【摘 要】
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本研究采用生物信息学方法将已知大肠杆菌、肺炎链球菌的PDF氨基酸序列与NCBI Gene bank中部分测序的肠球菌(Enterococcus faecium)基因组进行BLAST比较,获得肠球菌PDF同源序
【出 处】
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中国协和医科大学 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部
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本研究采用生物信息学方法将已知大肠杆菌、肺炎链球菌的PDF氨基酸序列与NCBI Gene bank中部分测序的肠球菌(Enterococcus faecium)基因组进行BLAST比较,获得肠球菌PDF同源序列.在该同源序列中含有其他微生物PDF酶活性必须的三个保守基序:Motif1{GXGXAAXQ}、Motif2{EGCLS}和Motif3{HEXDH}.通过基因序列比对分析,确定肠球菌中PDF同源序列的开放阅读框(open reading frame,ORF),用PCR扩增出该开放阅读框并进行测序分析.该扩增的肠球菌PDF同源序列与原核蛋白表达载体pET-30-a(+)连接后,转化蛋白表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.纯化诱导表达蛋白,使纯度达到90%以上.肠球菌PDF酶活性分析包括:酶与甲酰化三肽底物For-Met-Val-Ser相互作用的动力学特点,以及温度、pH对酶活力的影响.通过酶活性研究与Western blot分析证实了所获得的肠球菌PDF同源序列即为肠球菌的肽脱甲酰基酶基因,并将首次分离得到的肠球菌pdf登入NCBI Gene bank(Gene bank Accession number AY238515).以纯化的肠球菌PDF为靶点,首次建立了体外筛选其拮抗剂的分子高通量筛选模型,并用此模型筛选了近10,000个样品,其中化合物样品为2,000个,微生物发酵液样品为8,000个.在近10,000样品中,获得10个抑酶阳性样品,其中微生物发酵液样品8个,化合物样品2个.通过阳性样品对肠球菌的抑菌实验,发现放线菌03-4193的发酵液既有抑酶活性又有抗菌活性,而其他阳性样品都只有体外抑酶活性而没有抗菌活性.为此,对放线菌03-4193发酵液进行了粗提,初步确定其活性成分为水溶性化合物.
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