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研究背景和目的:癌症是全球最主要的公共卫生问题。肺癌的发病率和死亡率在众多类型的癌症中一直位居前列,是对人类健康威胁最大的肿瘤之一。化疗是肺癌治疗的重要手段,而顺铂目前仍作为肺癌治疗的一线用药被广泛使用。对顺铂细胞毒性机制以及耐药机制的研究由来已久,现如今程序性坏死这一新的细胞程序性死亡形式的出现,给顺铂相关机制的研究带来了新的方向。已有研究表明,顺铂可以诱导细胞发生程序性坏死,但能否通过诱导程序性坏死杀伤肺癌细胞仍无报道。众所周知,细胞凋亡抵抗是顺铂耐药的重要机制,细胞程序性坏死抵抗是否促进肺癌细胞对顺铂产生耐药目前却并不完全清楚。本课题拟针对以上两个关键问题进行研究。本课题分为三个部分:第一部分,顺铂诱导肺癌细胞程序性坏死及机制研究研究方法:1)光镜或电镜观察死亡细胞情况与形态;2)MTT法、LDH释放实验和流式细胞术检测药物处理的细胞毒性;3)Western blotting检测相关分子蛋白水平的改变;4)q-PCR检测相关分子mRNA水平的改变;5)细胞免疫荧光染色检测药物处理后相应分子表达或分布的改变;6)ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α含量;7)免疫组织化学染色检测肺癌组织中p-MLKL的表达;8)PI及Hoechst染色检测细胞死亡;9)免疫共沉淀检测细胞内蛋白质的相互作用。研究结果:我们检测了五株肺癌细胞系RIPK3的表达水平,发现A549细胞中RIPK3表达量最高。运用zVAD抑制细胞凋亡后,顺铂仍能诱导A549细胞死亡,死亡的细胞呈现程序性坏死的特点。程序性坏死抑制剂Nec-1及NSA可以抑制顺铂诱导的A549细胞死亡。通过免疫共沉淀的方法我们证实了顺铂处理的A549细胞中RIPK1、RIPK3以及MLKL可形成复合物,且顺铂处理后A549细胞中p-MLKL表达升高。肺癌患者临床样本免疫组织化学染色的结果显示术前运用新辅助化疗（化疗方案中包括顺铂）的肺癌组织的p-MLKL表达水平高于直接手术组的患者。我们发现顺铂处理后A549细胞中TNF-α表达水平升高且顺铂可促进A549细胞TNF-α自分泌。运用TNF-α中和抗体预处理细胞可以减轻顺铂诱导的程序性坏死。结论:顺铂可以诱导肺癌A549细胞发生程序性坏死。第二部分,PITPα与MLKL相互作用参与调控程序性坏死研究方法:1)免疫共沉淀检测细胞内蛋白质的相互作用;2)荧光共振能量转移实验检测活细胞内两分子的直接相互作用;3)非还原SDS-PAGE检测细胞内MLKL寡聚体形成;4)分离浆蛋白与膜蛋白检测MLKL的膜定位情况;5)RNAi技术检测PITPα对MLKL功能的影响;6)利用细胞免疫荧光染色检测MLKL在细胞内的分布情况;7)MTT法检测实验处理的细胞毒性;8)Western blotting检测相关蛋白表达情况。研究结果:我们发现,A549细胞中MLKL与PITPα可发生直接的相互作用。将MLKL分子截短表达后,我们利用荧光共振能量转移实验证实了MLKL的N端结构域与PITPα发生相互作用。根据RossetaDock获得的MLKL-PITPα复合体模型,我们构建了双点突变的MLKL突变体并证实突变体MLKLQ135P/Q138P与PITPα的结合能力下降。干涉PITPα影响了HEK-293T细胞中过表达的MLKL的膜转位与寡聚体形成。干涉PITPα也可影响顺铂处理的A549细胞中MLKL的膜转位与寡聚体形成。干涉PITPα可以减轻过表达MLKL引起的HEK-293T细胞死亡以及顺铂诱导的A549细胞死亡。结论:PITPα是MLKL的相互作用分子并且可参与调控程序性坏死。第三部分,程序性坏死抵抗促进肺癌细胞顺铂耐药及调控机制研究研究方法:1)CCK-8法、LDH释放实验和流式细胞术检测药物处理的细胞毒性;2)Western blotting检测相关分子蛋白水平的改变;3)q-PCR检测相关分子mRNA水平的改变;4)RNAi技术检测相关分子在细胞死亡信号通路中的作用;5)免疫共沉淀检测细胞内蛋白质的相互作用。研究结果:我们发现RIPK3分子在耐药细胞株A549/DDP细胞中表达低于亲本细胞,且A549/DDP细胞对于顺铂诱导的程序性坏死不敏感。过表达RIPK3后,A549细胞和A549/DDP细胞对顺铂诱导的细胞死亡敏感性增加,顺铂也可以诱导A549/DDP细胞发生程序性坏死。我们证实了肺癌细胞RIPK3的表达受到CNOT3的负向调控。对于A549/DDP细胞而言,细胞中CNOT3蛋白表达上调促使了其RIPK3的表达量低于亲本细胞。此外,我们还发现CNOT3的表达水平与肺癌细胞对顺铂的敏感性呈负相关。干涉CNOT3后,顺铂处理的细胞中外源性凋亡通路激活,凋亡细胞数量增加,而这一过程依赖表达上调的RIPK3对FADD和Caspase 8更多的募集。通过分析数据库中的数据,我们发现肺癌组织中CNOT3 mRNA表达量高于正常肺组织,而其高表达与肺癌患者的不良预后相关。除此之外,CNOT3参与调控肺癌细胞的增殖。结论:1、RIPK3表达下降导致的程序性坏死抵抗是肺癌细胞顺铂耐药的机制之一;2、CNOT3负向调控RIPK3表达,干涉CNOT3可使耐药细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性增加。