骨钙素(osteocalcin，OC)主要由成骨细胞表达分泌，是骨骼中含量最多的非胶原蛋白，OC包含两种形式:羧基化OC和非羧基化骨钙素(undercarboxylatedosteocalcin，unOC)。绝大部分羧基化OC沉积在骨基质中，一部分也被释放入血液;在骨吸收增加时，破骨细胞分泌的酸性物质使OC脱羧基，形成unOC，也分泌到血液中。因此，血液中含有羧基化OC和unOC。研究显示血液中的OC是骨转化的特异性标志物，可用于评价骨骼生长，检测骨骼疾病。最新研究揭示，血中OC为一种内分泌激素，可调节能量代谢。有关鸡OC的研究鲜见报道，也缺乏方便快速检测鸡血液OC的方法。本试验成功地研制了鸡OC原核表达蛋白、OC抗体及ELISA法，并研究了不同因素对OC及骨代谢的影响，探讨了蛋鸡OC与骨代谢及能量代谢的关系及其机理，其中制备的鸡OC抗体及建立的ELISA法在研究中得到了充分应用。　　为研制OC抗体及ELISA法，本试验使用Trizol法提取鸡额骨总RNA，应用RT-PCR技术克隆鸡OC基因，获得的目的片段与pMD18-Tsimplevector克隆载体连接，构建pMD18-T-chOCⅠ重组质粒，该重组质粒经亚克隆添加终止子TAG，获得含有终止子TAG的pMD18-T-chOCⅡ重组质粒。pMD18-T-chOCⅡ和pET-32a(+)表达载体分别被EcolⅠ和XholⅠ双酶切后，连接，构建重组表达质粒pET-32a(+)-chOC，并通过测序鉴定克隆质粒和表达质粒的的正确性。将质粒pET-32a(+)-chOC转化到Rosetta-gami(DE3)pLyS宿主菌，IPTG诱导后表达出含His标签的重组蛋白(His-rchOC)，经SDS-PAGE蛋白胶和Western-blotting鉴定蛋白是否正确表达。该蛋白使用His纯化小柱纯化后，肠激酶酶切去除融合蛋白中的His标签，获得rchOC蛋白。通过检测rchOC与羟基磷灰石结合性，及其对成骨细胞增殖和分化的影响，分析该蛋白的生物学活性。　　以His-rchOC重组蛋白为抗原，免疫4只雄性新西兰大白兔，制备多克隆抗体，根据间接竞争ELISA法原理制备鸡血清OC检测方法。鉴定该ELISA法的敏感性、准确性及溶血和稀释血清对该方法敏感性的影响，并使用该ELISA与商品化的鼠OCELISA试剂盒同时检测栖木笼养对蛋鸡血清OC的影响，进一步验证本方法的有效性和准确性。　　在成功地研制蛋鸡OC抗体及ELISA法的基础上，分别开展了蛋鸡洋葱日粮和高能低蛋白日粮试验，以探讨不同因素对蛋鸡OC、骨代谢及能量代谢的影响。　　一为蛋鸡洋葱日粮试验。48羽90周龄健康海南W36蛋鸡随机分成4组，每组12羽，每2羽饲喂在同一笼中，适应性饲喂1周后，更换日粮，饲喂含有0％（对照）、3％（低）、6％（中）和10％（高）的洋葱粉末饲料，持续饲喂4周。检测第0、14及29d体重变化，检测第7～9，19～21，27～29d采食量。在第29d，安乐处死所有蛋鸡，采集血液，测定血清钙、磷、碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和OC含量。双能X线检测肱骨、股骨和胫骨的骨密度、骨矿物含量、骨面积、骨长度和骨宽度。　　二为高能低蛋白日粮试验。100羽海兰褐壳蛋鸡随机分成两组，每组50羽，每两羽饲养在同一笼中，分别提供高能低蛋白日粮（highenergyandlowproteinprotein，HE-LP）和常规日粮（control）。适应性饲喂1周后，更换试验日粮，继续饲喂80d。记录蛋鸡产蛋率、采食量及体重。第80d，每组10羽放血处死。使用自动生化仪检测血液中钙、磷及碱性磷酸酶含量。ELISA法检测蛋鸡OC、瘦素样蛋白及雌激素含量。千分尺检测胫骨长度和宽度。放射密度法检测右侧胫骨密度，万能材料试验机检测左侧胫骨强度。Real-timePCR检测龙骨骨骼中OC基因表达变化，Western-blotting检测骨骼中OC蛋白表达变化。　　结果显示，本试验使用RT-PCR法成功地扩增获得含有148bp的chOC成熟肽基因，测序结果与GenBank报道的鸡OC序列完全一致，成功构建了pMD18-T-chOCⅠ和pMD18-T-chOCⅡ克隆质粒及pET-32a(+)-chOC表达质粒。原核表达获得的His-rchOC分子量约为26kD，与预期大小一致，能与His抗体结合。酶切后rchOC蛋白能与羟基磷灰石结合，抑制成骨细胞分化，但不影响成骨细胞的增殖。本试验成功表达His-rchOC蛋白，获得rchOC蛋白具有生物学活性。使用His-rchOC制备的兔抗鸡OC多克隆抗血清效价大于1∶107，OC多克隆血清经纯化后，获得特异性鸡OC多克隆抗体。该抗体可应用于Western-blotting检测骨骼中OC表达量。研制鸡OC间接竞争ELISA条件是:100μL1∶8000稀释的包被抗原加入ELISA板中，4℃包被过夜;次日PBST洗板1次，10％脱脂奶粉封闭;PBST洗板1次，加入50μL1∶5000稀释的抗体后和50μL标准品后不预混，直接加入洗涤好的包被板上，37℃孵育1h;弃去，PBST洗板5次，每次3min;加入100μL1∶11000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，37℃孵育1h;弃去，PBST洗板5次，每次3min，加入100μLTMB底物显色液，室温孵育10min，2MH28O4终止反应。本试验研制鸡OCELISA的最低检测下限是0.13ng·mL-1，批内差异和批间差异分别是＜7％和＜12％，具有良好的敏感性、准确性及精确性。溶血及稀释血清将降低ELISA的敏感性。该方法与商品化鼠OCELISA试剂盒同时检测鸡血清OC含量，获得的检测值之间具有相关性(P＜0.0001)，且使用本方法检测的血清鸡OC值比使用鼠OCELISA试剂盒获得的检测值高(P＜0.0001)。　　与非栖木笼养比较，栖木笼养可提高产蛋蛋鸡血清OC含量（P=0.04），而对生长期蛋鸡无影响（P=0.15），可用于预测蛋鸡骨质疏松的发生。含有洋葱的日粮未显著性影响蛋鸡体重和采食量，采食中剂量洋葱日粮蛋鸡产蛋量相对于采食低和高剂量洋葱日粮蛋鸡有增加的趋势，且中剂量组蛋壳强度比低剂量组显著增加（P=0.03）。洋葱日粮对血液OC等骨生物学指标无显著影响。相对于对照组，低剂量洋葱组肱骨骨矿物含量、股骨面积及肱骨宽度有增加的趋势，其他组无显著差异。采食高能低蛋白日粮蛋鸡产蛋率和采食量均低于对照组(P＜0.05)，体重、肝和腹部脂肪含量均比对照组高（P＜0.05）。血液OC、碱性磷酸酶、瘦素样蛋白、雌激素均比对照组高(P＜0.05)。Western-blotting结果显示，高能低蛋白组蛋鸡龙骨OC含量降低(P＜0.05)。相关性分析显示，血液中OC、瘦素样蛋白及雌激素间呈显著正相关。　　结论:本试验成功构建了pMD18-T-chOCⅠ和pMD18-T-chOCⅡ克隆质粒和pET-32a(+)-chOC表达质粒，表达出His-rchOC蛋白，获得rchOC蛋白具有生物学活性。制备出鸡OC多克隆抗体，并建立了鸡OCELISA法。该抗体具有较高的效价和敏感性，可用于Western-blotting检测骨骼中OC的含量。建立的ELISA法具有较好的敏感性、准确性和精确性，可用于检测鸡血液OC的含量。栖木笼养环境可提高产蛋后期蛋鸡血清OC含量，但对生长期蛋鸡无影响。给90周龄蛋鸡饲喂4周洋葱日粮，不妨碍蛋鸡的体重和采食量，可潜在地提高产蛋量和蛋壳强度，对血液OC等骨代谢血液指标和骨密度未有显著性影响。高能低蛋白日粮诱导脂肪肝疾病，增加骨转换，损害骨健康，证明脂肪过度沉积不利于蛋鸡骨健康，研究也显示了脂肪代谢与骨代谢具有密切的关系。