论文部分内容阅读
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,其能够分化为成骨、软骨和脂肪,为原始造血干/祖细胞在骨髓微环境中的生长和分化提供支持。近年研究发现,MSCs具有较高的分化潜能,甚至可以跨越分化为其他胚层来源的细胞,MSCs跨越分化肝细胞已成为该领域的研究热点之一。本研究重点研究小鼠肝脏损伤条件培养液中诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSSCs)向肝细胞分化的细胞因子,及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸(VPA)对人骨髓间充质干细胞(hBMSSCs)向肝细胞分化的促进作用。
第一部分:三种细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化作用的研究
目的:了解肝损伤条件培养液中FGF-4、HGF和OSM对mBMSSCs定向分化肝细胞的作用。
方法：用成骨细胞和脂肪细胞诱导液诱导mBMSSCs向成骨和脂肪细胞分化。检测肝损伤小鼠损伤不同时间点肝脏和肝损伤条件培养液中FGF-4、HGF和OSM的动态表达。用相应抗体封闭条件培养液中的FGF-4、HGF和OSM因子作为实验组,未封闭组作为对照组,诱导mBMSSCs向肝细胞分化。RT-PCR检测CK19、ALB、CK18和TAT的mRNA表达；免疫荧光检测AFP和ALB的蛋白表达；ELISA检测细胞ALB分泌水平；PAS反应检测分化细胞的糖原合成能力。
结果：成骨细胞诱导液能够诱导mBMSSCs分化为成骨细胞,脂肪细胞诱导液能诱导mBMSSCs分化为脂肪细胞。小鼠肝脏损伤后FGF-4、HGF和OSM的mRNA及蛋白表达水平均比正常组高。实验组与对照组相比,分化第10dCK18和分化第20dTAT mRNA的表达在对照组检测到,而实验组未检测到；免疫荧光检测分化第10dAFP和分化第20dALB蛋白低表达；ELISA检测分化20d时ALB蛋白分泌量明显降低；PAS反应检测糖原合成阳性率降低。
结论：抗体封闭肝损伤条件培养液中FGF-4、HGF和OSM,可明显抑制mBMSSCs向肝细胞的定向分化,提示FGF-4、HGF和OSM是诱导mBMSSCs向肝细胞分化的重要细胞因子。
第二部分:丙戊酸提高细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化率的研究
目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid,VPA)对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow stromal stem cells,hBMSSCs)向肝细胞分化的影响。
方法：利用密度梯度离心法和贴壁培养筛选的方法分离成年健康志愿者骨髓中的hBMSSCs。将分离得到的hBMSSCs用5mM的VPA预处理72h后,按照特定的细胞因子和生长因子组合诱导其向肝细胞分化,未加VPA处理的细胞作为对照组。诱导分化过程中,通过对VPA预处理组和未处理组细胞形态、分子和细胞功能检测,比较两组细胞的分化程度。利用免疫荧光染色和westernblot方法检测组蛋白H3和H4的乙酰化。
结果：与对照组相比,经VPA预处理的hBMSSCs,细胞因子诱导后能分化出形态更均一的肝样细胞,肝细胞标志性基因(AFP、ALB的mRNA和蛋白)表达水平更高。VPA处理后能明显提高分化细胞的肝细胞功能,表现在糖原合成,细胞色素P450活性和细胞尿素生成能力增强。5 mM VPA处理72 h后,细胞组蛋白H3和H4的乙酰化水平与处理前比,明显提高。
结论：VPA能够提高hBMSSCs分化肝细胞的效率,其机理可能是VPA抑制细胞去乙酰化酶活性,引起染色质乙酰化水平改变所致。