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酿造酒是人们日常生活中经常饮用的,它是通过微生物自身的代谢作用对各种粮食作物发酵产生的,在酿酒过程中也伴随着其他一些对人体有害物质的产生,甲醇便是其中一种。酿造酒中生成甲醇主要有两种途径,一种途径为发酵原料经代谢水解产生,另一种途径为酿酒酵母代谢甘氨酸生成。在酿酒过程中甘氨酸被酵母甘氨酸脱羧酶系催化生成甲醇,因此本文通过基因敲除方法消除酿酒酵母的甘氨酸代谢生成甲醇途径,实现酿造低甲醇健康酒。本实验用华南理工大学实验室保藏的一株酿酒酵母为出发菌,采用Cre-Lox P重组系统与醋酸锂转化法成功的敲除掉了酿酒酵母的基因GCV2,获得了一株基因缺失菌并命名为S2用该菌与出发菌株在制备的液态麦芽汁中进行酿酒发酵。将发酵后的酒利用静态顶空气相色谱法测定其相对甲醇的含量与此同时构建出测定甲醇的标准曲线方程为:y=0.0003x-0.0064。发酵结果为:酿酒酵母的相对甲醇含量为411.13 mg/L,20℃时的酒精度为8.8vol%,S2酵母的相对甲醇含量为329.88mg/L,20℃时的酒精度为9.7vol%,其中相对甲醇的含量较出发菌株减少了19.76%,酒精度的含量提高了10.23%。继续采用Cre-lox P重组酶系统对甘氨酸裂解酶系基因GCV1进行敲除,并挑取了7株阳性菌株先进行发酵实验,得到一株发酵性能相对较好,发酵液中相对甲醇含量较低的菌株编号为4,其发酵结果为酒精度12vol%,相对甲醇含量为223.33mg/l。用该菌株继续下面的实验并成功的构建出了基因GCV1缺失的酿酒酵母命名为S21,并将菌S2与菌S21分别在12°P的麦芽汁中,28℃的温度下发酵5天的时间,顶空气相测定发酵结果为菌株S2与菌株S21发酵酒中相对甲醇的含量分别为323.33mg/l,223.33mg/l,酒精计测得其20℃时的酒精度均为12vol%,所以菌S21发酵产物中相对甲醇含量比菌S2降低了30.93%。本文确定了对本发酵实验影响较大的三个单因素为温度,时间和糖度,通过响应面分析软件,选用Factors=3,Runs=18的Box-Behnken设计,进行组合实验。根据实验结果响应模型的回归方程分析,最终确定了改造菌株的最优发酵条件:温度为24℃、糖度150 g/L,时间为8天,此时的相对甲醇含量为75.92 mg/L。实验验证该条件下的发酵产物中相对甲醇含量发现于此结果较为接近。