面向航天流式细胞术的聚合物微流控芯片技术研究

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使用流式细胞术进行在轨白细胞计数能够有效地监控航天员的免疫功能状态,这对保障航天员的身体健康和载人航天任务的顺利执行具有重要意义,但传统流式细胞仪因体积大、缺乏微重力适应性、操作维护复杂等缺点难以满足载人航天的应用需求。相较于传统地面应用,航天用检测仪器需额外具备体积小、重量轻、微重力适应性、操作简便、高可靠性与易维护性、以及低消耗与低排放的特性。针对流式细胞术在载人航天应用中存在的问题及挑战,本文对其中的样本自动预处理、无鞘流细胞聚焦和激光诱导荧光检测这三个难题开展了研究,提出了全血自动预处理芯片和无鞘流细胞聚焦芯片两种聚合物基微流控芯片以及高容错荧光检测光路,形成了一套航天用全自动微流式细胞仪样机,在中国载人航天工程中得到了批量应用。主要研究内容如下:设计了一种集自动定量取样、试剂混匀和孵育等功能于一体的全血自动预处理微流控芯片。该芯片针对微重力环境下的样本预处理需求设计,使用基于高吸水树脂的延时截止阀实现了全血自动定量取样,利用段塞流特性与多通道液体混合技术实现了微重力环境下的高精度液体操控与高效率混合。对比试验表明该芯片能够获得与传统手动预处理相同的全血染色效果,有效解决了航天流式细胞术在微重力环境下的样本预处理难题。设计了一种基于泊松过程的无鞘流细胞聚焦微流控芯片。通过研究无鞘流通道聚焦中的泊松过程与检测区体积的关系,设计了截面尺寸为50μm×50μm的聚焦微通道,针对白细胞聚焦实现了0.54%的重复错误率。通过优化聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片制备中的热压、键合及芯片侧面抛光工艺,实现了细胞聚焦微流控芯片的小批量加工,并保证了聚焦微通道的形貌精度和位置精度。该微流控芯片能够即插即用,显著降低了航天员的操作难度,且六个外表面均具有较高的光洁度,为后续检测侧向散射光的正交光路提供了足够的光学检测面。针对无鞘流聚焦微通道的位置误差,提出了一种高容错荧光检测技术。该技术由芯片侧面入射488 nm波长的激发光,由芯片顶面检测侧向散射光(SSC)和异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻红蛋白-得克萨斯红(ECD)、和藻红蛋白-青色素(PC5)四种荧光。通过分析优化激发光光束整形参数对激发光能量分布的影响、以及荧光收集镜头对荧光收集效率的影响,实现了对包括微通道位置误差在内的大检测区的一致性荧光检测,在整个检测区内的激发光能量差异和荧光收集效率差异均小于2%。在上述三项关键技术的基础上,形成了一套航天用全自动微流式细胞仪样机,并进行了系统的测试和应用。结果表明:FITC荧光通道的荧光分辨率为4.0%,荧光灵敏度为916 MESF,侧向散射光灵敏度优于1μm,检测浓度为2000/μL的细胞样本时重复错误率<1%,且微流控芯片满足即插即用要求;具备淋巴细胞亚群分类计数能力,并成功应用于“绿航星际”4人180天受控生态生保系统集成试验中;通过抛物线飞行实验,成功验证了样机的微重力适应性。目前已在中国载人航天的免疫监测试验和训练中应用芯片318片。
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