病毒共感染是自然界中普遍的现象,在共感染过程中病毒复制、细胞表型、病理变化、宿主范围、组织嗜性和感染率等生物学特性都会发生变化。J亚群禽白血病病毒(ALV-J),属于反转录病毒科,可引起免疫抑制、生长迟缓和多种多样的肿瘤。禽网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE),同样属于反转录病毒科,指包括禽网状内皮组织増殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、脾坏死病毒(Spleen necrosis virus,SNV)、鸡合胞体病毒(Chicken syncytial virus,CSV)和鸭传染性贫血病毒(Duck infectious anemia virus,DIA)等多种网状内皮组织增殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)群的反转录病毒引起的一群病理综合征,典型病症为免疫抑制、矮小综合症和淋巴组织或其它组织形成的慢性肿瘤。在过去二十多年,我国大量流行病学调查报告显示ALV-J与REV的共感染普遍存在。除协同抑制抗体生成、促进致病性增强外,ALV-J与REV共感染最主要的特征为引起致瘤谱扩展,但其协同促进肿瘤谱扩展的机制至今未明。本研究以ALV-J和REV为模式病毒,通过研究其协同致瘤机制,为肿瘤病毒协同致瘤机制的深入研究奠定坚实的基础。为确定ALV-J与REV的协同作用,本研究首先通过体外共感染实验,建立了ALV-J与REV协同感染CEF模型。通过电镜观察,发现ALV-J与REV可同时侵染一个宿主细胞,进一步,CCK-8检测结果发现ALV-J与REV共感染可以协同延长细胞存活时间。qRT-PCR和western blot检测结果显示,ALV-J与REV在RNA和蛋白表达水平上均显示了协同复制作用。为进一步验证ALV-J与REV在体内的协同作用,我们建立了两种病毒共感染的动物实验模型。为获得更显著的协同作用,我们选择对6胚龄的鸡胚尿囊腔接种两种病毒。ALV-J与REV共感染后可显著降低孵化率,加剧生长迟缓和抑制中枢免疫器官发育。qRT-PCR检测结果显示,两病毒的协同作用发生于各个组织器官中。病理组织观察显示,ALV-J与REV共感染可加剧了肝门管区、肾脏间质及胰腺血管周围炎性浸润;加速了胸腺皮质和髓质区界限的消失;促进了心内膜上纤维瘤的生成。为确定参与ALV-J和REV协同致瘤的关键分子,我们对处在协同复制高峰时间点(72dpi)的同一批共感染的CEF细胞分别进行了iTRAQ蛋白组学和microRNA表达谱分析,对照组分别为单感染组和Mock组。通过与各单感染组相比,在共感染组中共筛选到差异显著的蛋白33个和差异表达的miRNA 7个,并发现肿瘤相关分子KIAA1199上调和肿瘤抑制物miR-147下调。为验证其表达的确实性,分别用qRT-PCR和western blot在共感染的培养细胞中进行了检测,结果符合组学检测结果。进一步,体内共感染实验中,通过qRT-PCR和IHC检测各组织中miR-147和KIAA1199的RNA和蛋白表达水平。qRT-PCR结果显示,共感染组鸡只在肝脏、肾脏、法氏囊、骨髓和心脏中KIAA1199 RNA表达量均显著高于各单独感染组,而miR-147的表达量却仅在骨髓、肾脏和心脏中显著下调;IHC检测结果显示,共感染组中仅骨髓、肾脏和心脏中KIAA1199蛋白表达量显著上升。以上结果说明,无论是体外培养的细胞还是体内的组织器官,ALV-J与REV均协同激活了原癌基因KIAA1199,同时抑制了肿瘤抑制物miR-147。此外,KIAA1199与mi R-147在不同组织和细胞中表达的反相关,暗示了两者之间存在着调控的关系。为探明ALV-J与REV协同感染过程中miR-147与KIAA1199的联系,我们通过RNA22、NCBI、ensemble和miRanda等数据库预测到了miR-147与KIAA1199的3’UTR区潜在的结合位点。我们分别构建了miRNA过表达载体miR-147 mimics和mi RNA干扰载体miR-147 inhibitor,并将其转染进共感染ALV-J与REV的CEF细胞体系中,western blot检测结果表明miR-147可显著降低KIAA1199蛋白的表达量,并且这种下降的趋势随着mi R-147浓度的减少而降低;miR-147的抑制剂可显著促进KIAA1199蛋白的表达量,并且这种增强效果随抑制剂浓度的增加而升高。我们分别构建了WT KIAA1199和mut KIAA1199双荧光素酶载体,与miR-147 mimics共同转染进293T细胞,通过双荧光素酶报告系统来检测miR-147是否可以直接与KIAA1199的3’UTR区结合。检测结果表明,当miR-147 mimics与WT KIAA1199同时转染293T细胞后,其相对荧光表达量极显著降低,并且这种下降的程度随miR-147浓度的增加而增加;当miR-147 mimics与mut KIAA1199同时转染293T细胞后,其相对荧光表达量与对照组差异不显著。以上实验表明,miR-147可通过靶向KIAA1199的3’UTR区调控KIAA1199蛋白的表达。ALV-J与REV协同激活了KIAA1199、抑制了miR-147,且miR-147与KIAA1199是靶向调控关系,那么,这一过程是通过何种通路实现的呢?先前有研究表明,在乳腺癌中,HPV病毒可激活NF-κB和EGFR信号通路来调控KIAA1199的表达。为明确ALV-J与REV协同激活KIAA1199的通路,分别用qRT-PCR、western blot和ELISA检测NF-κB p50、NF-κB p65、磷酸化的NF-κB p65和EGFR在感染细胞中的表达量。结果表明,与各单独感染组相比,共感染组NF-κB p50、NF-κB p65、磷酸化的NF-κB p65和EGFR的表达量均显著升高,而在体内实验中,共感染组中肾脏、骨髓、法氏囊和心脏的磷酸化IκBα和EGFR的表达量也同样极显著上调。以上实验结果说明ALV-J与REV无论在体外实验还是体内实验中均可以协同激活NF-κB和EGFR信号通路。为验证ALV-J与REV共感染过程中NF-κB、KIAA1199和EGFR这三者的关系,我们分别设计合成了KIAA1199 shRNA干扰物和NF-κB p65 shRNA干扰物,并在体外CEF细胞体系中,通过qRT-PCR、western blot和ELISA检测在干扰KIAA1199和NF-κB p65过程中NF-κB、KIAA1199和EGFR这三者的表达量。结果表明NF-κB p65可调控KIAA1199和EGFR的表达,而且KIAA1199也可以对NF-κB p65和EGFR的表达进行调控。综合以上结果表明,ALV-J与REV可通过NF-κB/KIAA1199/EGFR信号通路循环激活KIAA1199。研究表明,miR-147可以靶向EGFR相关蛋白来抑制EGFR信号通路,由于NF-κB、KIAA1199和EGFR这三者紧密联系,结合上述实验结果推测,miR-147对NF-κB相关蛋白也存在着抑制作用。我们同样用RNA22、NCBI、ensemble和miRanda数据库等预测到了mi R-147潜在靶向NF-κB p50的3’UTR区的结合位点。我们分别构建了WT NF-κB p50和mut NF-κB p50双荧光素酶载体,并运用与上述相同的检测方法来验证miR-147与NF-κB p50的关系。结果表明,除KIAA1199和EGFR外,miR-147还可通过靶向NF-κB p50的3’UTR区来调节NF-κB p50蛋白的表达。综上所述,本研究发现ALV-J与REV可协同激活一个新的原癌基因KIAA1199且抑制其抑制物miR-147,此过程是通过miR-147对NF-κB/KIAA1199/EGFR信号通路循环的关键调控作用实现的。本研究结果为肿瘤病毒协同致瘤机制的研究奠定了坚实的科学基础。