肿瘤免疫疗法通过激活自体免疫系统识别和攻击肿瘤细胞,是一种有效的肿瘤治疗策略。然而,肿瘤细胞通过诱导免疫细胞的免疫抑制或耐受表型,使其逃避免疫监视,显著降低了肿瘤免疫治疗效率。因此,针对肿瘤免疫抑制中的关键环节进行调控,是提高肿瘤免疫治疗效率的有效策略。据报道,金属离子在调节宿主免疫对抗病原体入侵中发挥着关键作用。特别是钙离子,作为第二信使,参与了免疫细胞的分化、基因转录和效应功能的调节。因此,金属离子激活的免疫疗法正在成为肿瘤的一种新型治疗方式。基于上述背景,本论文以药物递送系统为基础,以肿瘤组织内的钙离子调控为手段,构建钙离子调控型药物递送系统,揭示钙离子调控介导的肿瘤免疫抑制微环境激活及其协同药物治疗的机制,实现简单、高效的抗肿瘤免疫治疗。主要研究内容包含以下两个方面:（1）构建高效杂化鸡卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）的钙离子调控纳米药物（简写为HOCN）,阐明了其通过打破树突状细胞（Dendritic cells,DCs）抗原呈递中的多种障碍,显著增强抗原呈递的作用机制,实现了对小鼠结直肠癌的高效化学免疫治疗;（2）构建具有肿瘤微环境重塑特性的钙离子调控型基因药物递送体系（CaNP@cAD-PEG）,通过钙离子干扰介导的肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）重编程和肿瘤细胞特异性细胞程序性死亡-配体1（Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）沉默,双重作用促进肿瘤免疫治疗。具体内容如下:1.钙离子调控型药物递送系统通过打破DCs抗原呈递的多种障碍增强结直肠癌化学免疫治疗化学免疫治疗通过诱导肿瘤细胞免疫原性死亡（Immunogenic cell death,ICD）,激活T细胞免疫反应实现抗肿瘤治疗。在肿瘤免疫周期中,充分的抗原呈递是激活T细胞免疫反应的关键。然而,DCs作为最强大的抗原呈递细胞,其抗原呈递效率严重受制于肿瘤免疫抑制微环境:如癌细胞通过抑制DCs自噬降低抗原加工及呈递效率;肿瘤组织过量的乳酸降低了DCs活力和抗原摄取能力;有限的病原体损伤相关模式分子限制了DCs的成熟等。鉴于此,我们以模型抗原OVA为模板,采用原位矿化沉淀法制备了高效杂化OVA的具有蜂窝状结构的钙离子调控纳米药物HOCN,通过打破DCs抗原呈递的多重屏障,协同化疗药物米托蒽醌（Mitoxantrone,MTX）增强化学免疫治疗。制剂表征结果表明,HOCN具有均匀的球形蜂窝状结构,水合粒径约219nm,平均电位约-7.6 m V。在p H 6.5环境下,相比于实心纳米Ca CO3,HOCN的钙离子释放能力提高了约60%,乳酸中和能力提高了约37%。细胞活力实验结果表明,10μg/m L的HOCN即可将培养基p H值从6.5提高到7.02,使DCs的存活率从49%增加到75%,说明HOCN能有效中和乳酸,提高DCs活力,同时,其抗原摄取能力提高47.6%。体外摄取结果表明,得益于OVA蛋白的作用,HOCN能优先被DCs摄取。摄取后的HOCN在溶酶体酸性环境中快速释放钙离子,促进胞内自噬小体的形成（自噬小体的数量提高约4.6倍）,进而发现抗原被自噬小体的包封比率提高了3.4倍,显著的提高了DC细胞对抗原的再次加工能力,增强了DC细胞的抗原呈递效率（约6.6倍）。此外,HOCN通过提高肿瘤细胞内游离钙离子含量引起肿瘤细胞钙超载,协同MTX增强肿瘤细胞发生ICD,相比于单纯的MTX,HOCN分别使肿瘤细胞钙网蛋白表达量提高2倍,高迁移率族蛋白B1释放率提高1.45倍,三磷酸腺苷分泌量提高1.8倍。大量释放的肿瘤抗原协同对抗原的高效加工使DCs的抗原呈递效率提高了7倍左右。体内实验进一步表明HOCN可在肿瘤部位高效聚集,提高了MTX对肿瘤的抑制效果,抑瘤率高达78%,且具有较好的生物安全性。机制研究证实,HOCN使次级淋巴结DCs成熟比例提高了3.4倍,细胞毒性T淋巴细胞的瘤内浸润提高了7倍,说明HOCN协同MTX激活了有效的抗肿瘤免疫反应。小鼠双侧瘤模型结果表明,HOCN协同MTX对远端瘤的生长具有显著的抑制效果,脾脏效应记忆T细胞的比例提高了3.0倍,说明该纳米药物不仅激活了抗肿瘤免疫反应,同时诱导了有效的免疫记忆效应。总之,HOCN通过发挥以下作用打破DCs抗原呈递的多重屏障,提高抗原呈递效率:1)借助HOCN快速崩解消耗乳酸衰减肿瘤微环境酸性,提高DCs活力和抗原摄取能力;2)靶向DCs细胞,提高胞内钙离子水平诱导DCs自噬,促进抗原加工效率;3)基于结直肠癌细胞较低的钙离子调控能力,促进细胞内显著的钙超载,协同MTX增强肿瘤细胞ICD,促进肿瘤原位抗原释放。2.肿瘤微环境重塑特性的钙离子调控型基因药物递送体系增强黑色素瘤免疫治疗研究作为一种有前途的肿瘤免疫治疗策略,免疫检查点阻断疗法目前已被批准用于多种实体肿瘤如黑色素瘤,非小细胞肺癌和前列腺癌等的治疗,展示出了巨大的临床应用潜力。然而,其临床响应率受到肿瘤免疫抑制微环境,尤其是TAMs和肿瘤细胞免疫原性差的限制。此外,PD-L1抗体的全身应用往往会导致过激的全身免疫激活,造成显著的副作用。为了调控肿瘤免疫抑制的TAMs和选择性地抑制肿瘤细胞PD-L1的表达,本课题设计了钙离子依赖的、高效剪切PD-L1 m RNA的DNAzyme（简写为c AD）,以过氧化钙纳米粒（简写为Ca NP）为载体,通过静电吸附作用进行装载,并在其表面修饰DSPE-PEG2000,构建了具有肿瘤微环境重塑特性的钙离子调控型基因药物递送系统CaNP@cAD-PEG,并对其增强肿瘤免疫治疗的机制进行研究。为了实现肿瘤细胞特异性的PD-L1沉默,选择具有高效基因沉默效率的工具,并靶向递送至肿瘤微环境,有望解决该难题。研究表明,DNAzyme是具有催化作用的核酸,可以通过杂交识别目标,对特定的m RNA进行多次剪切,为实现肿瘤细胞PD-L1沉默提供了有力工具。然而,DNAzyme缺乏肿瘤细胞靶向性,并且体内稳定性较低。因此,本课题通过核酸杂交,构建了一种哑铃形环状肿瘤细胞靶向适配体-DNAzyme共轭物c AD。实验表明,与DNAzyme相比,c AD在10%FBS中的稳定性提高了至少3倍,剪切效率提高了约2倍,对黑色素瘤细胞的靶向性提高了约4.5倍。鉴于c AD的剪切效应需要足够的钙离子作为辅助因子,同时为了提高c AD在肿瘤部位的富集,本课题以过氧化钙纳米粒为载体,通过静电吸附作用装载c AD,并在其表面修饰DSPE-PEG2000,构建了钙离子调控型基因药物递送系统CaNP@cAD-PEG。制剂表征结果表明,CaNP@cAD-PEG形态均一,分散均匀,晶体结构完整,平均粒径180 nm,平均电位-13.2 m V,其中c AD的包封率约82.3%。体外药物释放实验表明CaNP@cAD-PEG能够在p H 6.5环境中高效释放c AD（3 h内释放率达到了75%）,钙离子释放率约42%。由于c AD的释放,CaNP@cAD-PEG在肿瘤组织弱酸性环境下可实现电荷反转（表面电荷由-13.2 m V升高至+16.8 m V）。在p H 5.0环境中钙离子的释放率高达63%,体外催化剪切结果表明CaNP@cAD-PEG在p H 5.0环境下释放的钙离子足以启动DNAzyme介导的PD-L1 m RNA高效剪切。细胞摄取实验结果表明c AD经Sgc8受体介导的内吞作用主动靶向进入肿瘤细胞,摄取率达61.1%。靶向性入胞的c AD在足量钙离子的催化下,导致了44.8%PD-L1 m RNA的降解,48.2%PD-L1蛋白下调,证实了CaNP@cAD-PEG通过钙离子介导的自激活基因沉默疗法成功地沉默了肿瘤细胞PD-L1表达。Ca NP被巨噬细胞摄取,通过提高巨噬细胞的胞内钙离子水平,使丝裂原活化蛋白激酶家族p38蛋白磷酸化水平提高了3.2倍,促使核因子κB的核转运,激活炎症相关分子的表达,其中白细胞介素12p70炎性细胞因子的表达提高了3.2倍,高效促使巨噬细胞表型转化。同时,巨噬细胞内钙离子介导的线粒体钙超载和线粒体损伤,通过产生活性氧促进NLRP3炎性小体通路的激活,Casepase-1蛋白水平提高了5.2倍,白细胞介素1β的分泌水平提高了近4倍。以上结果证明了CaNP@cAD-PEG具有优异的巨噬细胞表型转化能力。此外,Ca NP进入肿瘤细胞后,通过介导肿瘤细胞钙超载,促进肿瘤细胞ICD,增强肿瘤抗原原位释放。体内药效实验表明CaNP@cAD-PEG可在肿瘤部位积累,使M1型巨噬细胞比例提高了47.6%,M2型巨噬细胞比例降低了46.8%。且相比于临床使用的PD-L1抗体,本课题构建的钙离子调控型基因药物递送系统显著降低了黑色素瘤细胞PD-L1的表达,从而避免了PD-L1抗体全身应用导致的心脏炎性毒性。最终,CaNP@cAD-PEG通过诱导巨噬细胞表型转化协同肿瘤细胞特异性PD-L1下调,有效激活了抗肿瘤免疫反应,使得肿瘤抑制率高达71.1%。总之,本课题通过精巧设计DNAzyme（c AD）并与钙离子载体结合,构建了多功能的肿瘤微环境调控纳米平台,为改善肿瘤免疫微环境提供了一种新策略,具有潜在的临床应用价值。