细胞迁移是多细胞生物体的一项重要生命活动，参与胚胎发生、伤口愈合、炎症反应以及癌细胞侵袭转移等多种生理病理过程。同时，细胞迁移又是一个非常复杂的生物学过程，需要多种内部因素和外部因素共同作用完成。外部因素主要是指细胞外的各种信号分子，内部因素则包括细胞内的信号传导系统和控制细胞运动的骨架蛋白、分子马达以及参与细胞运动的各种细胞结构。细胞核是真核细胞最大和最硬的细胞器，其形态、定位、力学特性的改变与细胞的迁移能力密切相关。　　骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）不仅具有自我更新能力和多向分化潜能，而且具有归巢、迁移至组织受损部位的能力，通过增殖、旁分泌、分化和抗炎等多种作用，在损伤组织修复和再生中扮演重要角色。在从骨髓中动员并向损伤组织位点定向迁移过程，BMSCs的迁移能力受到多种力、化学因素的影响。骨桥蛋白（osteopontin, OPN）是一种分泌型的磷酸糖蛋白，广泛分布于机体组织/细胞中。OPN与其受体相互作用参与组织/细胞多种生理病理过程，具有重要的生物学功能。OPN在机体损伤部位的表达升高，可作为一种趋化因子诱导细胞发生定向迁移。实验室前期研究发现，OPN可以明显促进 BMSCs的迁移能力，但其分子机理尚未阐明，特别是细胞核力学特性在OPN促BMSCs迁移过程中的作用及其调控机制更不清楚。　　为了进一步探究OPN促BMSCs迁移过程中细胞核力学特性的变化及其分子机理，本文以大鼠BMSCs为研究对象，利用原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）检测了OPN作用下BMSCs细胞核杨氏模量的变化，并进一步研究了影响核力学特性变化的两个主要因素，即核纤层蛋白lamin A/C的表达和染色质结构的变化，并考察了OPN促BMSCs迁移中细胞核与细胞质的相互作用，最后研究了FAK-ERK1/2信号途径在OPN影响BMSCs细胞核力学特性中的信号介导作用。主要研究内容和实验结果如下：　　①大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定　　本文采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞。结果显示，分离培养的细胞呈纤维状，折光率高；群体形态呈漩涡样单层，细胞形态趋于一致。流式细胞术分析表面抗原发现分离培养的细胞表达CD90、CD44而不表达CD34，符合BMSCs表面抗原的一般特征。综合细胞形态学观察以及流式细胞检测的结果，可确认分离培养的细胞为BMSCs。　　② OPN通过降低细胞核杨氏模量促进BMSCs迁移　　细胞核的力学特性与细胞迁移密切相关。利用Transwell检测发现，OPN可促进BMSCs迁移。利用AFM检测发现，未经OPN处理组的细胞核杨氏模量为1.00±0.14 kPa，OPN处理组细胞核杨氏模量为0.34±0.08 kPa。与对照组相比，OPN作用BMSCs后显著降低了BMSCs细胞核的杨氏模量。结果表明，OPN能显著降低BMSCs细胞核硬度。　　③ OPN通过降低核纤层蛋白（lamin A/C）的表达促进BMSCs迁移　　细胞核骨架蛋白lamin A/C是细胞核力学特性的主要决定因素之一。为了进一步分析细胞核力学特性变化的原因，利用RT-PCR和Western blot检测lamin A/C的表达是否发生变化。结果表明，OPN作用BMSCs后可明显降低lamin A/C的表达。为了明确lamin A/C表达与细胞迁移的关系，构建了lamin A/C的过表达载体和干扰载体。重组载体包装成为慢病毒后感染 BMSCs，在细胞内实现了对 lamin A/C的过表达和敲减。实验发现，过表达lamin A/C增加了细胞核的硬度，降低了OPN诱导的BMSCs迁移；而干扰lamin A/C表达则降低了细胞核的硬度，增加了OPN诱导的BMSCs迁移。结果表明，OPN通过影响lamin A/C表达改变细胞核的硬度从而影响BMSCs的迁移。　　④ OPN通过调节染色质结构促进BMSCs迁移　　染色质结构是影响细胞核力学特性的另一重要因素。AFM和 Transwell检测发现，减弱BMSCs染色质的凝集程度能导致细胞迁移能力下降，说明染色质结构变化可影响细胞的迁移行为。DNaseI敏感性实验检测发现，OPN可促进异染色质发生凝集。进一步用Western blot检测染色质发生凝集的原因，发现OPN可促进异染色质标志物 H3K27me3及其甲基转移酶 EZH2的表达升高。EZH2抑制剂DZNep能显著降低OPN诱导的EZH2和H3K27me3表达，降低细胞核杨氏模量以及BMSCs的迁移能力。进一步构建了EZH2干扰载体，包装慢病毒后感染细胞，使细胞内EZH2的表达下调。敲减BMSCs的EZH2表达，可降低H3K27me3的表达、细胞核杨氏模量以及BMSCs迁移能力。表明OPN可通过诱导EZH2的表达，上调异染色质标志物H3K27me3，使细胞核染色质凝集，从而诱导细胞的迁移。　　⑤ OPN通过F-actin调节细胞核力学特征促进BMSCs迁移　　细胞核-细胞质的耦合是影响细胞迁移的重要因素。为验证OPN促细胞迁移过程中信号传递到细胞核的机制，检测Cytochalasin D（Cyto D）和Jasplakinolide（Jasp）改变 F-actin结构后细胞核力学特性是否发生变化。免疫染色发现， OPN作用BMSCs时，Cyto D和Jasp也能明显使F-actin解聚或促聚合。进一步研究发现， F-actin解聚或者促聚合可调控细胞核的投影面积及杨氏模量。利用siRNA对LINC复合物的主要成分 SUN1蛋白进行敲减，结果发现细胞核杨氏模量降低，细胞迁移下降。说明破坏LINC复合物可能阻断了细胞在迁移过程中的细胞质向细胞核的信号传递途径，从而影响细胞迁移。　　⑥ FAK-ERK1/2信号通路在OPN促BMSCs迁移中的介导作用　　前期研究表明OPN可通过FAK-ERK1/2信号通路影响BMSCs骨架结构和细胞迁移。为了进一步明确FAK-ERK1/2信号通路是否介导OPN信号从细胞质到细胞核的传递，使用Western blot检测OPN作用后FAK、ERK1/2的活化表达情况。结果发现，与对照组相比，OPN作用组磷酸化的 FAK（phospho-FAK, p-FAK）、ERK1/2（phospho-ERK1/2, p-ERK1/2）的表达显著提高。利用PF573228、PD98059分别抑制FAK、ERK1/2的活化表达，结果显示，两种抑制剂处理后在不同程度上抑制了细胞的迁移。进一步研究发现，FAK或ERK1/2抑制剂可以缓解OPN诱导的细胞核杨氏模量的下降，同时使lamin A/C蛋白表达有所回升。以上结果表明， FAK-ERK1/2信号通路参与了OPN对lamin A/C的表达和细胞核硬度的调节。　　进一步检测了FAK-ERK1/2信号是否参与OPN对染色质结构的调控。实验结果发现，抑制FAK信号分子，EZH2和H3K27me3的表达未发现明显变化，而抑制ERK1/2信号分子，可降低OPN诱导的染色质凝集，并降低OPN诱导的EZH2和H3K27me3的表达。实验结果表明，OPN可通过ERK1/2信号增加异染色质标志物 H3K27me3及其甲基转移酶 EZH2的表达，促进染色质的凝集，从而诱导BMSCs的迁移。　　综合上述结果，OPN可能通过降低 lamin A/C的表达和增加染色质凝集来调节细胞核的力学特性，从而促进BMSCs定向迁移。研究结果阐明了细胞核力学特性在OPN促BMSCs迁移过程中的作用及其调控机制，为临床上应用 BMSCs修复受损组织提供了理论指导。