脉络宁抑制过氧化氢诱导的神经元损伤及其机制探讨

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背景:传统中药脉络宁在国内广泛应用于缺血性卒中、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病、冠心病等治疗已有20余年的历史,其作用机制尚不清楚。研究报道脉络宁可增加纤溶活性,防止红细胞凝集;扩张血管,使灌流增加,防止心、脑缺血性损伤,防治脑、冠状动脉血栓形成以及改善微循环。近年应用现代技术手段,分离和鉴定的脉络宁注射液成分多达87种,并发现其主要成分绿原酸、咖啡酸、肉桂酸均具有抗氧化活性。由于氧化应激在缺血性脑损伤形成过程中发挥重要作用,其对脂质、蛋白质及核酸的损伤可以直接导致神经元凋亡和死亡。因此,我们设想脉络宁可能通过抗氧化应激途径减轻缺血后神经元的损伤,并进一步研究其可能的作用靶点。  目的:确定脉络宁是否对H2O2诱导的胎鼠原代皮层神经元氧化应激损伤具有保护作用,以及探讨其作用机制。  材料:脉络宁(南京金陵药业),ROS试剂盒(Beyotime分子技术公司,中国),SOD、Cu/ZnSOD、MDA试剂盒(南京建成生物技术公司,中国),线粒体膜电位试剂盒(GMS10013.1,GENMED,美国),过氧化物酶活性试剂盒(Beyotime分子技术公司,中国)  方法:胎鼠原代皮层神经元分离培养,分为空白对照组、脉络宁对照组、H2O2处理组、脉络宁治疗组。空白对照组:皮层神经元培养+培养基24小时+培养基24小时;脉络宁对照组:皮层神经元培养+培养基24小时+脉络宁(1.25μg/mL)24小时;H2O2处理组:皮层神经元培养+H2O2(80μmol/L)24小时+培养基24小时;脉络宁治疗组:皮层神经元培养+ H2O2(80μmol/L)24小时+MLN(1.25μg/mL)24小时。  主要检测指标:采用MTT法及流式细胞仪检测神经元存活率与死亡率,流式细胞仪检测ROS产量,荧光染色法检测线粒体膜电位,改良NBT法检测SOD活性,分光光度计检测Cu/ZnSOD、过氧化氢酶活性,采用脂质过氧化法检测MDA。  结果:H2O2可诱导神经元死亡,降低神经元存活率(p<0.05),增加ROS产量及MDA浓度(p<0.05),使线粒体膜电位下降,降低SOD、Cu/ZnSOD及过氧化氢酶活性(p<0.05)。脉络宁可显著逆转这些改变,其使ROS产量降低11.78%,使MDA水平降低19.4%,可以升高线粒体膜电位,提高细胞总SOD及线粒体Cu/ZnSOD的活性,其最为显著的作用使正常神经元过氧化氢酶的活性提高28.74%,使H2O2损伤后神经元过氧化氢酶活性提高116%。  结论:脉络宁可以通过降低ROS与MDA,提高线粒体膜电位,增加SOD及过氧化氢酶活性保护H2O2诱导的神经元损伤。
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