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目的：从创伤性截肢患者术中切下的膝关节软骨中用蛋白酶消化和酸溶解的方法提取人可溶性Ⅱ型胶原,采用人Ⅱ型胶原作为固相抗原,建立间接酶联免疫吸附试验检测Ⅱ型胶原自身抗体的方法.对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA) 、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)、骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者和正常对照组血清中Ⅱ型胶原自身抗体进行检测,并对其临床应用价值进行评价.
方法：1.从创伤性截肢患者术中切下的膝关节软骨中提取并纯化Ⅱ型胶原,并用SDS-PAGE法和双向免疫扩散试验对所得Ⅱ型胶原纯度和抗原属性等进行鉴定.2.利用人Ⅱ型胶原为抗原更具有同源性,同时优化反应条件,建立Ⅱ型胶原自身抗体的间接ELISA法.并对本方法进行方法学评价,包括特异度和精密度等指标.3.收集类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和骨关节炎患者,以及健康体检人群的血清标本,检测Ⅱ型胶原自身抗体的含量并进行临床应用评价.
结果：1.从创伤性截肢患者膝关节软骨中提取的Ⅱ型胶原与鸡Ⅱ型胶原纯品的抗原性和分子量均相同,双向免疫扩散试验结果显示,在提取液和鸡Ⅱ型胶原纯品抗原与鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体孔之间形成一端相互融合成弧形乳白色沉淀线;SDS-PAGE结果可见在蛋白质分子量标志物97.4KD处附近出现单一条带,与鸡Ⅱ型胶原纯品电泳条带位置相符.成功建立了间接ELISA法检测Ⅱ型胶原自身抗体,该方法具有良好的精密度,其批内和批间变异系数(CV﹪值)分别为6.48﹪、9.38﹪和16.63﹪、13.04﹪.通过羊血清的应用和运用棋盘滴定法确定最佳工作浓度等方法来优化反应条件,提高检测灵敏度和特异性,抑制实验结果显示,随着加入的Ⅱ型胶原标准品浓度的增加,OD值逐渐降低,两份样本的抑制率分别为16.41﹪、23.44﹪、36.72﹪和15.22﹪、32.61﹪、41.30﹪,说明试验具有较好的特异性. 2.33例RA患者和109例SLE患者血清Ⅱ型胶原自身抗体的含量均显著升高,检测OD值的95﹪可信区间分别为0.31～0.61和0.46～0.59,与60例正常对照组(0D值的95﹪可信区间为0.20～0.27)比较有显著性差异(P均<0.01);而33例OA患者组血清Ⅱ型胶原自身抗体的含量(0D值的95﹪可信区间为0.06～0.10)显著低于正常对照组、RA患者组和SLE患者组(P均<0.01);RA患者组和SLE患者组血清Ⅱ型胶原自身抗体的含量无显著性差异(P>0.05).经ROC曲线分析,得用血清Ⅱ型胶原自身抗体诊断自身免疫性关节炎的ROC曲线下面积(AUC-ROC)为0.794(95﹪CI:0.134～0.854),OD值0.27为临界值时,灵敏度为69.0﹪、特异度为66.7﹪、阳性预测值为85.5﹪和阴性预测值为43.0﹪.经相关性分析,RA患者血清Ⅱ型胶原自身抗体与目前临床常用的RA活动性指标CRP、RF、ESR和CCP抗体及临床病情程度均无明显相关性(P>0.05);SLE患者血清Ⅱ型胶原自身抗体与SLE活动性指标ANA和抗ds-DNA抗体阳性率办无明显相关性(P>0.05).
结论：1.采用人可溶性Ⅱ型胶原作为固相抗原检测血清Ⅱ型胶原自身抗体水平的ELISA间接法具有敏感、特异、重复好、操作简便等特点,为Ⅱ型胶原自身抗体临床应用创造了检测条件.2.自身免疫性关节炎患者血清中Ⅱ型胶原自身抗体水平的显著变化,为Ⅱ型胶原自身抗体作为自身免疫性关节炎的诊断指标提供了理论依据和实验数据.3.血清Ⅱ型胶原自身抗体水平与RA和SLE患者病情活动性指标不相关,血清Ⅱ型胶原自身抗体的检测不能作为RA和SLE患者病情严重程度和活动性的评价指标。