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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个全球性的公共卫生健康问题。全球约有3.5亿人感染HBV,每年约有100万人死于乙型肝炎及其并发症。HβV感染的慢性化(持续性感染)有可能引起肝细胞持续性损害和肝纤维化,进一步发展成为肝硬化和肝细胞癌。病毒与宿主的相互作用决定着病毒感染的清除或持续性感染的建立。与此相一致的是,已有研究表明宿主因素在HBV持续性感染中发挥作用。本室前期针对HBV持续性感染开展了一项大规模的全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS),发现人类染色体8p21.3区域是HBV持续性感染的易感基因组区域,INTS10基因是HBV持续性感染的候选易感基因。在本研究中,我们在人肝细胞系中通过过表达和敲低实验对INTS10抗HBV感染的功能进行了初步的探索。首先在整合了INTS10或其对照质粒的永生化人肝细胞系L-02和人肝癌细胞系HepG2中转染pAAV-HBV1.2复制型质粒,72小时后收集细胞及上清进行检测。结果显示,与对照空质粒相比,过表达INTS10可显著下调HBV复制中间体DNA的水平和HBV RNA的表达水平,以及降低HBsAg、HBeAg抗原的分泌水平。除了L-02和HepG2细胞系之外,我们还在因稳定整合HBV基因组而组成性产生HBV的人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞中同时整合了INTS10或其对照质粒,相等细胞数铺板,72小时后收集细胞及上清进行检测。结果显示,与对照空质粒相比,在HepG2.2.15细胞中过表达INTS10同样可显著下调HBV复制中间体DNA的水平和HBV RNA的表达水平,但是HBsAg、HBeAg抗原的分泌水平则没有发生显著变化。随后我们在L-02、HepG2和HepG2.2.15细胞中干扰内源性INTS10的表达,检测内源性INTS10的表达变化对HBV复制的影响。结果显示,在L-02、HepG2细胞中,下调内源性INTS10的表达可显著增强HBV DNA的复制、HBV RNA的转录及HBsAg、HBeAg抗原的分泌水平。在HepG2.2.15细胞中下调内源性INTS 10的表达同样增强了HBV DNA的复制、HBV RNA的表达,但是对HBsAg、HBeAg抗原的分泌却无影响。总之,上述研究结果证明INTS10在抗HBV复制过程中发挥着重要的作用。接下来,我们进一步探索INTS10抗HBV复制的分子机制。INTS10是整合因子复合体(Integrator complex)家族中的一员。整合因子复合体参与小核RNA的加工,对mRNA前体的剪接至关重要,能够影响mRNA的持续合成能力和表达水平。但是,整合因子复合体如何在HBV感染过程中发挥作用尚未见报道。为了寻找INTS10发挥抗HBV作用的潜在机制,我们首先采用高通量基因芯片技术检测了31例HBV相关肝组织样本的mRNA表达谱,然后按照INTS10的表达水平分为高表达组和低表达组,并寻找在两组之间存在差异表达的基因,最后使用DAVID工具对这些差异表达基因进行通路富集分析。结果显示,剪接体信号通路(spliceosome signaling pathway)和维甲酸诱导基因Ⅰ样受体信号通路(retinoic acid-inducible gene-I-like receptor,RLR)与INTS10的表达显著相关(P值分别为1.5×10-5和1.8×10-3)。剪接体与HBV感染的研究尚未见报道,但是已有研究显示RLR信号通路的成员维甲酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene-I, RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5 (melanoma differentiation-associated gene 5, MDA-5)可以感知HBV和激活机体固有免疫反应来抑制HBV的复制。为此我们将机制研究聚焦到RLR通路,推测INTS10是通过RLR信号通路来抑制HBV的复制。为了证实我们的推测,首先在L-02、HepG2细胞中共转染PLV-INTS10-EGFP质粒和pAAV-1.2HBV质粒或敲低细胞内源性INTS1O同时转染pAAV-1.2HBV质粒,72小时后收集细胞,进行蛋白提取,来验证INTS10对RLR通路相关基因的影响。而在HepG2.2.15细胞中则只需过表达PLV-INTS10-EGFP质粒或敲低细胞内源性INTS10,72小时后收集细胞提取蛋白,同样进行RLR信号通路相关蛋白的检测。Western blot的检测结果表明,过表达INTS10, IRF3总蛋白下调,而p-IRF3(ser396/ser386)则上调,而p65/p-p65 (ser536)、IκBa/p-IκBα(ser32/36)的表达则未发生变化。相反,干扰细胞内源性INTS10表达后,P-IRF3(ser396/ser386)则下调,p65/p-p65 (ser536)、IκBa/p-IκBa(ser32/36)的表达也未发生变化。我们还在L-02、HepG2和HepG2.2.15细胞中过表达INTS10或沉默INTS10,观察ISRE的转录活性是否发生改变。报告基因结果显示过表达INTS10可激活ISRE,敲低INTS10可抑制ISRE的转录活性。这样的结果在L-02、HepG2和HepG2.2.15三个细胞系中都得到了一致的验证。下游效应分子检测结果显示,肝细胞过表达INTS10后IFN-λ的mRNA表达水平上调,沉默肝细胞内源性INTS10后IFN-λ的mRNA表达下调。通过Western blot实验及报告基因实验,可初步确定INTS10在抑制HBV复制的过程中可激活IRF3。为了确定INTS10是依赖于IRF3发挥抗HBV作用的,我们在HepG2.2.15细胞系首先敲低IRF3,36小时后再过表达INTS10,72小时后检测细胞中HBV DNA、HBV RNA及HBsAg、HBeAg的表达水平。结果显示敲低IRF3后再过表达INTS10, INTS10的抗HBV作用减弱或消失,下游抗病毒效应分子IFN-λ的表达也不再上调,说明INTS10抵抗HBV复制是部分通过上调p-IRF3(ser396),激活IFN-λ的表达来起作用的。为了进一步在体内验证INTS10抑制HBV复制的功能,我们在100例HBV感染者的血浆样本中检测了INTS10的表达情况,发现持续感染者血浆中INTS10的表达比自限恢复者低,且血浆中INTS10的表达与HBsAg的表达呈负相关。此外,在14例HBV自限恢复者和40例HBV持续感染者肝组织样本的免疫组化结果显示,INTS10与P-IRF3的表达呈正相关,而与p-p65的表达则无相关性。这些来自临床样本的实验结果支持了细胞学水平的结果,即INTS10可能通过激活IRF3来发挥抗HBV效应。总之,本研究首次通过实验证明INTS10在肝细胞中发挥抗HBV的功.能,并且其抗HBV复制的功能是部分通过激活IRF3及IFN-λ来实现的。我们的研究揭示了机体抗HBV复制的一个可能的新机制,为HBV相关肝病的防治提供了新的线索。