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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家与地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。同其它多数病毒病的防制一样，免疫接种仍是预防与控制PRRS的主要措施。目前用于预防PRRS的主要商用疫苗是传统常规疫苗弱毒疫苗和灭活疫苗。但已证实弱毒苗存在散毒及高几率毒力返强的安全隐患，国外许多国家已禁用弱毒苗。灭活苗尽管安全性较好，但不仅需多次重复接种，而且免疫效果不理想，还经常可导致免疫失败。因此，迫切需要更安全、高效、廉价的新型疫苗来预防和控制PRRS的发生与流行。 蛋白转导是新近发展和建立起来的一种富有生命力的新技术。其高效的跨膜转运功能和在细胞间自主传递的特点，为提高新型疫苗免疫效应提供了新的思路和有效手段。目前已证实具有独特蛋白转导特性的来源于a-疱疹病毒亚科的VP22同源物，能显著提高与之融合的外源蛋白的递呈效率进而提高其免疫原性，并证实可显著提高DNA疫苗或腺病毒载体疫苗的免疫效应，其中牛疱疹病毒1型(BHV-1)VP22是极具开发应用潜力的新型高效的蛋白转导免疫增强佐剂分子。 鉴于此，本研究以PRRSV两个最主要的保护性抗原基因—经修饰具有更好免疫原性的ORF5基因(ORF5M)以及ORF6基因为靶基因，以BHV-1 VP22为免疫增强佐剂分子，开展了以伪狂犬病毒(PRV)为载体的PRRS双基因及佐剂活病毒载体疫苗以及PRRS双基因及佐剂DNA疫苗研究，主要研究内容如下： 1、双基因及佐剂重组伪狂犬病毒TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的构建与免疫反应采用PCR方法从含BHV-1 VP22基因及PRRSV ORF5M基因的质粒中，扩增到不含终止子的VP22基因以及ORF5M基因的完整编码区，并进行了克隆和序列分析，经序列测定证实两基因均未发生碱基突变。将ORF5M及VP22基因依次插入到PRV通用转移载体pIECMV中，构建了含VP22-ORF5M融合基因的PRV转移质粒pIECMV-VP22ORF5M。再将与VP22基因融合的PRRSV ORF6基因表达盒插入到pIECMV-VP22ORF5M中，构建了含VP22-ORF5M与VP22-ORF6融合基因的PRV转移质粒pIECMV-VP22ORF5M-VP22ORF6。采用脂质体介导法将转移质粒与EcoRI线性化后的PRV gE基因缺失标记疫苗株TK~-／gE~-／LacZ~+基因组共转染IBRS-2细胞，出现细胞病变(CPE)的转染产物经蚀斑纯化结合PCR扩增筛选，构建了融合表达VP22与ORF5M基因的单基因及佐剂重组伪狂犬病毒(rPRV)TK~-／gE~-／VP22E~+，以及共表达与VP22融合的ORF5M与ORF6基因的双基因及佐剂rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+，并经PCR、Southern blot、Western blot、IFA证实构建正确，外源融合基因得到表达，并具有免疫学活性。而且外源基因的插入不影响rPRV在IBRS-2或PK-15细胞上的增殖。