NAD（P）H:醌氧化还原酶1（NAD（P）H:quinone oxidoreductase,DT-diaphorase,NQO1,QR1,EC 1.6.99.2）是一种依赖FAD的黄酮类蛋白,属于黄素蛋白家族,能够催化醌和醌类化合物（醌亚胺）,硝基芳香族化合物及偶氮染料的双电子还原为对苯二酚,目前被广泛应用于醌类解毒、清除O2-,维持内源性抗氧化剂,调节p53和蛋白酶体降解、染料脱色等领域,但是发现自然界存在的醌氧化还原酶,有着酶活性较低、表达水平受限等特性,在其应用方面受到了极大的限制。因此,以hNQO1作为研究对象,通过定向进化的方法获得高活性、高效率的突变菌株,并应用于染料脱色方面的研究。主要研究内容和进展如下:1.将实验室保存的hNQO1菌株进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳检测并确定分子量为30.8 k Da,利用镍柱成功实现了hNQO1蛋白的纯化,并使用BCA蛋白定量法对纯酶进行蛋白浓度测定,紧接着对野生型hNQO1进行酶学特性和动力学检测的实验,结果表明:在p H 1.95酸性条件下酶活较好;最适温度为45℃,且在30℃-45℃该酶的酶活是随着温度升高的;在热稳定性的实验中,发现在30℃-40℃hNQO1较稳定,稳定性随温度的升高而下降。野生型hNQO1的Km值为0.5637 mmol·L-1,Kcat值为0.086·s-1,催化效率Kcat/Km值为0.153 L·（mmol·s）-1。2.为提高hNQO1的活性,本研究主要针对hNQO1的目的基因进行分子改造。通过易错PCR选择不同Mn2+浓度随机突变目的基因,并以大肠杆菌为宿主细胞进行表达,构建以E.coli BL21（DE3）p ET28a-hNQO1为起始菌的突变文库,利用孔雀石绿脱色作为醌氧化还原酶酶活的高通量筛选方法,对突变文库中的2300多株突变菌株进行筛选,利用96孔板进行初筛、复筛后,再通过摇瓶复筛高酶活性的突变体,最终获得三株活性高于野生型的突变菌株1-C7、4-C10、7-G12,将其进行蛋白纯化发现是野生型菌株酶活的2.45倍、3.41倍、3.48倍。3.利用大肠杆菌为宿主细胞表达的野生型hNQO1在不同甘油浓度（100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L、750 mmol/L、1 mol/L）下对孔雀石绿进行脱色实验,并比较突变体（1-C7、4-C10、7-G12）和野生型hNQO1对孔雀石绿的脱色能力。结果表明,在甘油浓度为100 mmol/L时,野生型hNQO1对孔雀石绿的脱色率为12.9%,而突变体1-C7对孔雀石绿的脱色高于野生型hNQO1,为29.9%;突变体4-C10在甘油浓度为250mmol/L时,脱色率为45.3%高于野生型hNQO1（14.5%）;7-G12突变菌株在甘油浓度为500 mmol/L时的脱色率为30.9%,并且发现这三株突变体（1-C7、4-C10、7-G12）对孔雀石绿的脱色不会随着甘油浓度的增加而持续上升。4.选用野生型hNQO1对6种介体小分子（1,4-萘醌、蒽醌-2-磺酸钠盐、甲基对苯醌、1,4-二羟基蒽醌、蒽醌、甲萘醌）进行筛选,选择适宜浓度的介体小分子（1,4-二羟基蒽醌）辅助hNQO1全细胞(菌体密度OD600为10)对偶氮染料（刚果红、苋菜红）进行脱色。结果表明,利用1,4-二羟基蒽醌作为小分子介体对刚果红进行脱色,野生型hNQO1菌体能够重复利用三次,每次反应时间为6 h,脱色率分别为94.0%,79.7%和20.3%。与刚果红相比,hNQO1全细胞对苋菜红（反应6 h）的脱色率为18.8%。降低菌体密度为2.5(OD600),比较野生型和突变体（1-C7、4-C10、7-G12）在1,4-二羟基蒽醌介体辅助下对刚果红、苋菜红的脱色能力。结果表明,野生型hNQO1全细胞对刚果红及苋菜红的脱色率分别为29.5%、9.8%;突变体（1-C7、4-C10、7-G12）对刚果红进行脱色（反应6 h）,脱色率分别为33.0%、30.9%、33.4%;而对苋菜红的脱色率（反应6 h）为6.4%、15.1%、14.4%。