水稻调节铵吸收基因筛选及拟南芥铵吸收调节机制研究

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zmeng1984
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氮是植物重要的营养元素,约占其干重的2%,并且与作物生产联系密切。硝酸和铵根离子是高等植物主要的氮营养源。植物可通过根系中的铵运输蛋白(Ammonium transporters,AMTs)从土壤中直接吸收铵离子,或者通过还原土壤中吸收的原硝酸根离子在体内积累铵。本研究以水稻和拟南芥为试验材料,围绕铵耐性水稻的铵吸收和代谢基因筛选、铵敏感性拟南芥的铵吸收调节机制进行试验研究和分析,得出以下主要结果:1.调节水稻铵吸收和代谢基因的筛选根据文献报道,高浓度铵会让水稻等作物主根的根尖卷曲,因此本研究把铵对水稻幼苗期根生长的抑制作用定为筛选指标。利用一组含有玉米转座子Ac(Activator)/Ds(Dissociation)的水稻种子,通过愈伤组织培养再分化系统,共获得600多个突变体。在此突变体库中共筛选出了7个对高浓度铵敏感的突变体。再通过根表型稳定性测试,检测F2代水稻植株中有根尖卷曲表型植株的比例是否吻合孟德尔遗传中3:1的分离规律。经过检测,我们发现共有3个突变体吻合孟德尔遗传规律,其Ds插入位点与调节水稻铵吸收和代谢有关。针对其中的m1突变体,利用反向PCR(iPCR)和测序技术鉴定,得出在m1突变体中Ds插入在谷氨酰胺合成酶1;2(GS1;2,Os03g0223400)基因的第二个内含子中,是一个水稻中与铵吸收和代谢有关的基因;此基因含11个外显子和10个内含子。本实验结果对于铵代谢与水稻等作物根系发育研究具有参考价值。2.拟南芥油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)信号对铵吸收的影响本研究发现BR信号通路的激活可负调控铵转运蛋白基因AMT1和谷氨酰氨合成酶和谷氨酸合成酶基因(GS/GOGAT)的表达。前人已初步探索了NH4+介导的AMT1基因表达抑制机理是氮的代谢物而不是NH4+影响AMT1基因的转录。BES1(BRI1-EMS-suppressor 1)是BR信号通路中重要的转录因子,本实验显示BES1功能增效突变体(bes1-D)能部分抑制NH4+介导的GS/GOGAT基因表达。NH4+的再补充能抑制AMT1基因的表达,但NH4+介导的AMT1基因表达抑制在bes1-D中被制止。在野生型(En2)和bes1-D中,经谷氨酰胺处理,AMT1基因的表达得到抑制,提示BES1可能是通过抑制NH4+介导的GS/GOGAT基因表达,从而制止bes1-D中AMT1基因表达的抑制。3.拟南芥中光受体和油菜素内酯信号传导之间相互关系光对植物的生长和发育至关重要,光被光受体识别。前期研究中报道,拟南芥AMT1的表达水平在白天要高于黑夜。而BR激素调节着植物生长和发育的多个方面,包括光形态发生、光和BR信号之间相互作用。因此,本研究探讨了光受体和AMT1及BR表达之间的关系。(1)光受体对AMT1表达的影响:phyB9(far-red light receptor mutant),phyA211/phyB9(red and far-red light receptor double mutant)和phot1-2/cry1-2(blue light receptor quadruple mutant)突变体中AMT1;1基因的表达显著高于野生型;phyA211(red light receptor mutant),phot1-2和cry1-2(blue light receptor double mutant)突变体中AMT1;1基因的表达较野生型无显著性变化。(2)光受体和BR信号之间的关系:cop1-4(constitutive photomorphogenic 1 mutant)和HY5 ox(long hypocotyl 5 overexpression mutant)突变体在暗条件下对BR的不同反应,提示在暗条件下,BR促进cop1-4突变体下胚轴伸长源于COP1和BZR1的相互作用,而不是通过HY5的过表达。光受体突变体对BR的反应显示phyA211,phyA211/phyB9和phot1-2/cry1-2对外源性的BR不敏感。为了进一步分析BR对光受体突变体的作用,本研究应用了BR生物合成抑制剂丙环唑(PCZ)。在100 nM PCZ条件下,cry1-2和phot1-2/cry1-2突变体对PCZ不敏感,phyB9和phyA211/phyB9突变体对PCZ敏感性较低。但在光照条件下,高浓度的PCZ(1μM)完全抑制了cry1-2和phot1-2/cry1-2突变体下胚轴的伸长,表明cry1-2和phot1-2/cry1-2突变体下胚轴的伸长需要BR活性。通过分析光受体突变体中BR标记基因表达水平,显示不同的光受体突变体对BR生物合成和信号基因的调节不同,表明光受体在一定程度上调节BR信号通路。未经PCZ处理,在phot1-2/cry1-2突变体中BR标记基因的表达与bzr1-D突变体相似;但经过PCZ处理,在phot1-2/cry1-2突变体中,SAUR15和ACS5基因的表达完全被抑制。而在bzr1-D中,PCZ没有完全抑制SAUR15和ACS5基因的表达。以上数据显示光受体负调控BR信号。相反,在bri1-5和bzr1-D突变体中光受体的表达显示BR信号在转录水平上负调控光受体。4.拟南芥AtBS14b过表达对油菜素内酯信号的影响AtBS14b作为一种SNARE蛋白(N-ethyl-maleimide sensitive factor adaptor protein receptor),在铵刺激后其转录水平具有明显的上调趋势。但在拟南芥中过表达At BS14b的发现,过表达植物的下胚轴和叶柄明显比对照组短。大量前期研究报道,下胚轴和叶柄细胞的延伸受激素的调控,如油菜素内脂(BR)和赤霉素(Gibberellic acid,GA)。在本研究中,AtBS14b ox植株对外源性的BR不敏感,另外,BR介导的生物合成基因(BR6OX2,CPD和DWF4)抑制在AtBS14b ox中被制止。同时,Split GFP和酵母双杂交实验显示,AtBS14b是与MSBP1作用,而不是与BRI1或BAK1。本研究提供了一种AtBS14b调节MSBP1内吞噬及BR信号传导的可能模式。
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