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CD4+辅助性T细胞(CD4 helper cells,Th细胞)是机体T细胞的重要功能群体,在机体的适应性免疫应答中发挥了关键作用。通常情况下,初始CD4+T细胞在活化后可分化为Th1细胞、Th2细胞、CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)、辅助性T细胞17型(T helper17,Th17细胞)和滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells,Tfh细胞)等5个主要亚群。新近研究显示,局部微环境细胞因子的差异和相关特定转录因子的活性水平可显著影响初始 CD4+T细胞分化为Th细胞各个亚型的过程。大量研究表明,CD4+T细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等临床疾病发生、发展过程中发挥了重要作用,然而关于CD4+T细胞功能的调控机制至今仍未完全阐明。 微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类由内源基因编码的参与基因转录后水平调控的长约22-24个核苷酸的非编码蛋白质的单链RNA,其能与目的基因的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)结合,在转录后水平通过促进靶mRNA的降解或抑制蛋白质翻译来负调控目的基因的表达。miRNAs在胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡和糖脂代谢等一系列生物学进程中发挥了重要的调控作用。近年来越来越多的研究报道,miRNAs参与了CD4+T细胞的发育和功能调控过程,影响了临床相关疾病如炎症和肿瘤的发生发展过程。因此,分析特定的miRNAs与CD4+T细胞之间的关系将有助于揭示CD4+T细胞功能维持及调控疾病的分子机制。 miR-126是miRNAs家族中重要的一员,位于EGFL7基因7号内含子中,其在血管和心脏、肺等组织器官的内皮细胞中高表达。新近大量研究报道miR-126与免疫细胞的发育和功能维持过程密切相关。此外,我们课题组前期也发现miR-126可通过PI3K/AKT调控CD4+CD25+调节性T细胞的外周诱导,提示其在机体免疫应答中具有重要调控作用。然而,miR-126与CD4+ T细胞功能的相关关系至今仍不十分明确。本研究拟利用miR-126基因敲减小鼠模型,探讨miR-126对CD4+T细胞功能的影响以及可能分子机制,以期为后续深入探讨miR-126在免疫应答中的作用及机制提供前期实验基础。 本研究包括三部分内容,分述如下: 目的: 第一部分利用miRNA-Sponge技术,设计 miR-126-Sponge序列,构建靶向miR-126的真核表达载体pEGFP-C2-miR-126-Sponge(海绵体),制作miR-126基因敲减(knock down,KD)小鼠模型,并观察小鼠各重要组织器官的病理学变化。 第二部分利用免疫荧光技术和流式检测技术,结合实时荧光定量 PCR技术,从体内外探讨miR-126敲减后对CD4+T细胞活化、增殖和相关细胞因子分泌等功能以及凋亡的影响。 第三部分利用基因芯片技术和实时荧光定量 PCR技术,结合 Targets Scan软件和Western Blot技术,初步探讨miR-126对CD4+T细胞功能影响的分子机制。 方法: 第一部分:设计并合成miR-126-Sponge序列,构建靶向miR-126的真核表达载体pEGFP-C2-miR-126-Sponge,利用FVB背景的小鼠,在广州赛业公司的支持下,制作miR-126KD小鼠。然后分别抽提第8-12周WT小鼠和miR-126KD小鼠的肾、肠、肺和肝等12个重要生命器官的总 RNA,检测 miR-126的下调效率;同时观察WT小鼠和miR-126KD小鼠体重和外周血糖变化,HE染色检测肺、肝、脾和胸腺等器官的病理改变,并计数脾、胸腺等免疫器官的细胞总数;最后流式仪检测CD4+T细胞的比例改变。 第二部分:免疫荧光技术检测WT小鼠和miR-126KD小鼠脾组织CD4+ T细胞的组成和分布改变;利用MACS技术分选CD4+CD62L+T细胞后,实时荧光定量PCR技术检测 miR-126的表达;体外无菌条件下获得脾组织单细胞悬液,用ConA或抗CD3/CD28抗体加IL-2刺激淋巴细胞,显微镜下观察增殖效率,流式仪检测CD4+ T细胞的活化、增殖和相关细胞因子分泌的变化;同时用实时荧光定量 PCR技术检测CD4+ T细胞相关细胞因子表达的改变;最后用PI染色法检测CD4+ T细胞的凋亡情况和用DSS诱导的肠炎模型和过继传输试验探讨在体内miR-126对CD4+T细胞功能的影响。 第三部分:提取WT小鼠和miR-126KD小鼠脾淋巴细胞总RNA,送基因芯片测序,筛选出差异表达基因;运用Targets scan和miRWalk软件预测miR-126可能作用的靶分子,经筛选,选定 IRS-1作为 miR-126的靶分子;进一步利用实时荧光定量PCR检测WT小鼠和miR-126KD小鼠脾CD4+CD62L+ T细胞中IRS-1的表达变化Westernblot技术检测WT小鼠和miR-126KD小鼠脾淋巴细胞AKT、ERK、NF-κB的磷酸化水平。 结果: 第一部分:电泳结果和测序结果显示,成功构建pEGFP-C2-miR-126-Sponge真核表达载体;将其转染肝癌HepG2细胞后,实时荧光定量PCR检测结果显示,miR-126的表达水平显著下调(p<0.05);在广州赛业公司的支持下,成功制作miR-126KD小鼠;进一步利用实时荧光定量PCR检测发现,miR-126KD小鼠的肺、肝、肾等重要生命器官的miR-126的表达水平显著下调(p<0.05);体重监测结果显示,miR-126KD小鼠的体重增长速度从第10周起明显高于WT小鼠(p<0.05);同时,miR-126KD小鼠的外周血糖水平在第7周和第16周显著高于WT小鼠(p<0.05)。HE染色结果显示,miR-126KD小鼠的肺、肝及肾等的病理结构发生显著改变。更重要的是,miR-126KD小鼠脾重量和细胞总数明显增加(p<0.05),且流式检测结果显示,miR-126KD小鼠的CD4+T细胞的比例显著增加(p<0.05)。 第二部分:免疫荧光共聚焦试验结果显示,miR-126KD小鼠脾组织中CD4+T细胞显著高于WT小鼠;体外脾细胞增殖试验显示,miR-126KD小鼠CD4+T细胞增殖加快;同时,流式检测结果进一步显示,在活化状态下,miR-126KD小鼠CD4+T细胞 CD69、CD44、ki-67、BrdU的比例显著增加,而CD62L的比例显著减少,相关IL-4的表达显著减少,IFN-γ的表达显著上调(p<0.05),而在未活化状态下,BrdU的改变不明显;同时实时荧光定量PCR检测结果表明,miR-126KD小鼠IL-4和IL-10的表达显著下调,而IL-12、TGF-β、TNF-α、IFN-γ的表达显著上调(p<0.05);最后PI染色法检测显示,miR-126KD小鼠CD4+T细胞凋亡的比例明显减少(p<0.05),体内试验结果显示,miR-126敲减后增强了CD4+T细胞的活化、增殖能力。 第三部分:基因芯片分析筛选出大量差异表达的基因,与WT小鼠相比,IRS-1的表达上调2.7005倍;运用TargetScan和miRWalk软件预测,miR-126可与IRS-1的3’UTR结合,提示IRS-1是miR-126作用的靶分子;实时荧光定量PCR结果显示,miR-126KD小鼠CD4+T细胞中IRS-1的表达显著上调(p<0.05);最后,Western blot检测结果显示,miR-126KD小鼠CD4+T细胞中AKT、ERK、NF-κB的磷酸化水平显著增加(p<0.05)。 结论: 第一部分:成功制作靶向miR-126的基因敲减小鼠;同时,miR-126敲减后,小鼠各重要组织器官均发生明显病理改变,且脾CD4+T细胞的比例显著增加。 第二部分:miR-126敲减后,CD4+T细胞活化、增殖和相关细胞因子的分泌均明显增强,而凋亡明显减少,表明miR-126能显著调控CD4+T细胞的功能。 第三部分:miR-126敲减后,miR-126KD小鼠CD4+T细胞IRS-1和磷酸化AKT的表达水平均显著上调,提示miR-126可能通过IRS-1/PI3K/Akt信号通路调控CD4+T细胞的功能。