背景和目的：结肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤。在西方经济发达国家，结直肠癌的死亡率位于恶性肿瘤的第二位。近二十年来，结直肠癌在我国的发病率总体上呈上升趋势，我国结肠癌发病率己占所有恶性肿瘤的第4位。并且随着人们饮食结构和生活方式的改变，结肠癌的发病率还会继续上升。结肠癌的发生是涉及多基因、多步骤的复杂过程，国内外学者对结肠癌的发病机制进行了深入的研究，但其诊治方法仍未获突破性进展，进展期结直肠癌的五年生存率仍未得到根本性提高，因此积极开展结肠癌发生机制的研究对于结肠癌的防治具有很重要的现实意义。 X-连锁的凋亡抑制蛋白(X-linkedinhibitorofapoptosisproteinXIAP)是凋亡抑制蛋白家族中作用最强的一种，参与了多种恶性肿瘤的增殖和转化。X-连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(XIAP-associatedfactor1，XAF1)是一个新发现的XIAP作用蛋白。通过拮抗XIAP抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的活性发挥抗XIAP作用，共表达XAF1和XIAP能引起XIAP向细胞核内迁移并阻碍XIAP依赖的Caspase-3活性的抑制。XAF1是一个待定的肿瘤抑制基因，与正常组织相比，XAF1在人类恶性肿瘤(各种细胞株、胃癌、黑色素瘤等)中表达低下，并与肿瘤的凋亡、增殖及其预后的产生有密切关系。 细胞的凋亡与肿瘤的发生发展、临床治疗有密切的关系，是肿瘤生长的重要调节因素之一，最近的研究显示，肿瘤细胞的凋亡缺陷是一种常见现象。维甲酸类化合物是良好的诱导分化剂，干扰素具有抗肿瘤和免疫调节作用。γ-干扰素(interferon-γ)、全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)可以通过调节某些抗凋亡基因，促进某些肿瘤细胞凋亡，干扰素与维甲酸联合应用可以增加抗肿瘤疗效，成为治疗恶性肿瘤新近研究热点之一。 本实验以体外培养的人结肠癌细胞株SW1116为靶细胞，以IFN-α和ATRA为刺激因子，从蛋白活性、mRNA、基因转录调控水平及信号传导方面等不同层次深入进行了IFN-α和ATRA对结肠癌细胞XAF1基因表达及转录凋控的影响及其分子机制的研究，并探讨XAF1正反义寡核苷酸在IFN-α和ATRA介导SW1116细胞凋亡中的作用。为进一步深入研究XAF1的转录调控机制奠定了基础，也为XAF1基因的临床应用提供实验依据。 方法： 1)IFN-α和ATRA作用前后XAF1表达和转录活性的测定。 选取结肠癌细胞株SW1116为研究对象，应用半定量逆转录聚合酶链式反应(Reversetranspcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)和蛋白免疫印迹(WesternBlotting，WB)从mRNA和蛋白表达两个水平检测XAF1的差异表达。为进行XAF1基因转录活性的检测，我们克隆了一个位于XAF1基因5侧翼区的调节片段，该片段含有XAF1基因的核心启动子(-107bp～+164bp)，在这里临近翻译初始密码子ATG上游的核苷酸定义为-1。设计引物序列如下：上游引物5-GATCTCCTCUTCCCTGAA-3，下游引物5-GTCTCCAGCTGCTTGTCCTC-3，KpnI酶切位点加入到上游引物的5端，XhoI酶切位点加入到下游引物中。以Lovo细胞的基因组DNA为摸板采用HotstartTaq酶进行PCR扩增。经KpnI和XhoI分别双酶切载体pGL3-hasic和PCR产物后，将纯化的PCR产物插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游方向上构建成启动子荧光素酶重组质粒(pLUC107)。含有XAF1启动子报告基因质粒和载体pRL-CMV通过Lipofectamine2000转入细胞，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性用双荧光素酶报告基因系统在TD20/20型荧光测定仪上进行检测，启动子转录活性用与空载体pGL3-basic比较的相对荧光素酶单位(relativeluciferaseunit，RLU)来表示。RLU=萤火虫荧光素酶单位值/海肾荧光素酶单位值。 2)IFN-α和ATRA通过何种机制激活XAF1基因上游顺式调控元件。 通过用Tfsearch软件对XAF1基因5-侧翼区序列的搜寻，我们发现在XAF1基因的-38bp～-30bp序列与干扰素调节因子1结合元件(interferonregulatoryfactor1bindingelement，IRF-E)序列有76.2％的一致性，将此序列命名为IRFE-XAF1。包含有假定的IRF-E序列的XAF1基因的双链特异DNA探针是5-GCCTGCAAGAAACGAAACTCAACCGA-3，IRF-1通用的探针序列是5-GGAAGCGAAAATGAAATTGACT-3。为明确其是否是XAF1基因的一个顺式调控元件，我们用同位素标记XAF1-IRFE双链探针，采用凝胶电泳迁移分析(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)实验检测IFN-α和ATRA对XAF1-IRFE结合活性的影响，并用过量的未标记的公认IRF-1探针与核提取物进行孵育，用特异性竞争抑制实验证实其结合的特异性。为进一步弄清IFN-α和ATRA是否通过IRFE-XAF1序列激活XAF1表达，使用定点突变试剂盒产生XAF1启动子区的-28nt和-34nt点突变。以pLuc107为摸板，在野生型和突变型双链引物的引导下，用PfuDNA聚合酶进行PCR扩增反应的延伸反应，正反向引物延伸产物的配对即产生带缺刻的突变质粒，产物用DpnI内切酶消化父代DNA模板，质粒DNA在XLI-BLUE感受态细胞中扩增，测序后，转染SW1116细胞后，进行荧光素酶活性的检测。突变引物序列如下： 野生型为：GCCTGCAAGAAACGAAACTCAACCGAAAGCC。 -34点突变序列：GCCTGCAAGAAAAGAAACTCAACCGAAAGCC。 -28点突变序列：GCAAGAAACGAAACCCAACCGAAAGCCTGC。 3)正反义XAF1寡核苷酸在SW1116细胞中的表达和IFN-α和ATRA介导细胞凋亡中的作用。 以正反义XAF1寡核苷酸为实验组，以空白组、空载体为对照组，研究转染正反义XAF1寡核苷酸对于人结肠癌SW1116细胞凋亡的影响。转染细胞经IFN-α和ATRA诱导后，采用RT-PCR和Westernblotting观察XAF1mRNA和蛋白质表达水平：采用Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡细胞核情况，MTT法测定存活细胞数，运用Caspase活性检测试剂盒观察凋亡蛋白酶Caspase-3的活化情况。 结论： 1)通过RT-PCR和报告基因分析证明了IFN-α和ATRA可以在转录水平升高XAF1基因的表达。 2)通过蛋白免疫印迹分析证明了IFN-α和ATRA可以在蛋白表达水平升高XAF1基因的表达。 3)EMSA证明了IFN-α和ATRA可以增强IRF-E元件的结合活性。 4)定点突变证明IRFE介导了IFN-α和ATRA诱导的XAF1表达。推测IFN-α和ATRA升高XAF1基因表达可能的作用机理是其增强IRFE元件的结合活性。 5)XAF1正义寡核苷酸可明显增加XAF1mRNA水平及蛋白质水平的表达，并促进IFN-α和ATRA所致SW1116细胞凋亡发生。 6)XAF1反义寡核苷酸可明显抑制XAF1mRNA水平及蛋白质水平的表达，并抑制IFN-α和ATRA所致SW1116细胞凋亡发生。