蜡蚧菌是重要的虫生真菌,可寄生温室粉虱、多种蚜虫、蓟马等多种害虫,在无公害农业生产中广泛应用于防治温室蔬菜害虫,表现出优良的的防治效果,但其防效受多种因素的影响并存在一些弱点,突出表现为杀虫速度较慢,在害虫数量发生较大时,很难迅速压低虫口数量。本研究选择将特异性杀虫的外源的蜘蛛毒素基因导入蜡蚧菌,构建工程菌株,改良蜡蚧菌的毒力,并对其改良效果进行评价。主要研究结果如下:1.刺吸式害虫优势寄生菌的分离鉴定:采用单孢分离的方法,对从感病的粉虱上分离得到的座壳孢进行形态学和分子生物学鉴定,对比实验室以保存的蜡蚧菌CA-14的生物学特性及其刺吸式害虫对寄主的选择,最终确定以蜡蚧菌为供试材料进行毒力改良。2.外源蜘蛛毒素基因的选择及其人工合成:通过文献调研,在GenBank中对昆虫相关毒素基因信息进行大量比较,遴选出对昆虫有特异作用的澳大利亚漏斗网蜘蛛的毒素基因ω-ACTX-Ar1a。利用分子技术人工合成该基因的编码区(委托专业公司合成),将其连接至载体pUC57质粒中并转化大肠杆菌,利用PCR技术和抗性标记筛选阳性克隆子,提取重组质粒,以其为模板PCR扩增得到大量的毒素基因片段。3.构建了毒素基因的ω-ACTX-Ar1a表达载体:以pBHt2质粒为模板克隆真菌的启动子PtrpC,以pAN7-1质粒为模板,克隆真菌的启动子PgdpA和终止子TtrpC。利用重叠和降落PCR将目的基因和不同的启动子和终止子连接,构建了两个重组片段“PtrpC-ω-ACTX-Ar1a”和“PgdpA-ω-ACTX-Ar1a-TtrpC”。通过对重组片段和载体pBHt2质粒的序列和酶切位点的分析,以KpnI和HindIII为限制性内切酶,在T4 DNA连接酶的作用下,将重组片段与经限制性内切酶酶切的pBHt2质粒连接,构建了重组质粒的表达载体Pω和PωT。4.利用农杆菌介导的遗传转化法转化蜡蚧菌:制备农杆菌AGL-1的感受态,将重组质粒Pω和PωT载体导入农杆菌中,利用含有重组质粒的转化后的农杆菌与蜡蚧菌CA-14共培养,在乙酰丁香酮的诱导下,使目的基因随机插入蜡蚧菌中。在潮霉素B抗性的筛选下,随机挑选100株不同的转化子进行抗性筛选验证和遗传稳定性分析。提取不同转化子的DNA,以DNA为模板进行PCR检测目的基因,结果显示,66株转化子含有目的基因,转化效率为66%。对这些转化子在进行遗传稳定性分析,在不含潮霉素B抗性的PDA培养基上连续培养5代,发现转化子均能正常生长。再以这些能正常生长的转化子进行RT-PCR转录表达分析,发现20株转化子在RNA水平上成功表达。对成功表达的20株转化子目的基因的拷贝数进行荧光定量PCR检测,选择单拷贝基因NIF3为内参基因,得到单拷贝的转化子有8株,多拷贝转化子5株。5.将得到的重组菌株进行毒力测定及其效果评价:以无翅的菜缢管蚜为供试昆虫,以无菌水(含0.1%的吐温80),对转基因菌株和原始的蜡蚧菌进行毒力测定,结果显示,转基因菌株的毒力效果不一,对蚜虫的致死时间有不同程度的缩短,其中毒力效果最好的Pω-40和PωT-2的LT50分别为4.615 d和4.517 d,相较于原始菌株的6.824 d缩短了分别缩短了2.209 d和2.307 d。表明导入的外源毒素基因提高了蜡蚧菌的毒力,缩短了害虫致死的时间。