镍(Nickel)是人类在生产和生活中广泛接触的一种金属元素。常接触镍的职业包括：镍的冶炼、提纯、电镀、制造不锈钢以及生产镍铬电池等。人群流行病学调查和动物实验均已证实镍的职业性接触可以引起癌症,主要是肺癌,国际癌症研究中心(IARC)1990年将镍及其化合物列为第一类致癌物,其中尤以镍尘NiS和Ni3S2致癌性最强,其次为Ni2O3。目前有关镍致癌机理的研究主要集中在四个方面：一是镍诱导ras、P53等基因突变的形成,继而导致癌相关基因表达异常,诱发肿瘤的形成；二是镍诱导细胞内信号转导的改变,引起转录因子的异常活化并导致基因表达谱的改变,继而导致肿瘤的形成；三是镍诱导细胞产生的氧自由基可以导致细胞内遗传物质的损伤,影响癌相关基因的表达,最终导致肿瘤的发生；四是镍除了直接诱导基因组的表达之外,还可通过表观遗传学的改变,继而影响癌相关基因的表达,促进肿瘤的发生。目前有关镍诱导肿瘤发生以及肺损伤的研究很多,但是由于镍在人体中代谢的复杂性,镍致癌的分子机制到目前为止并未完全阐明,因此本文将镍化物诱导活性氧产生、激活信号转导通路、诱导细胞中核转录因子的活性以及中医药的干预实验对镍致癌的分子机制进行初步探讨,试图为镍致职业性肺癌的预防和中药治疗予以理论上的探索。方法1.体外培养支气管上皮细胞(16HBE),分别用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-8.0μmol/L)、NiS (2.0μmol/L)+扶正解毒(FJD)含药血清(低、中、高剂量组、空白血清组)处理细胞24h,用台盼蓝法检测支气管上皮细胞的存活率。取对数生长期的16HBE细胞接种于24孔培养板内,6×106个／孔,每个剂量设5个复孔,按实验分组分别加入受试物,继续培养24h,各组细胞弃去上清液,每孔加入500μl细胞裂解液,冰上放置30min,将裂解液作用后的各组细胞转移至Eppendorf管,离心20min,取上清液进行谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)活性检测。将受试物处理后的各组细胞以PBS反复洗涤细胞,直至显微镜下大部分细胞已超声破碎,进行超氧化歧化酶(SOD)活性的检测。用考马斯亮兰蛋白测定法,用分光光度计测定波长595nm处吸光度OD值,计算蛋白含量,结合蛋白浓度计算16HBE细胞(细胞处理方法同前)内丙二醛(MDA)含量。2.将16HBE细胞接种于25ml培养瓶中,每孔接种的细胞数为6×106,培养24h后,用NiS (1-5.0μmol/L)染毒,并用无菌的MEM、NiS (2.0μmol/L)+不同剂量FJD含药血清、空白血清、以及三种抑制剂,磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化氨基未端蛋白激酶(P-JNK)处理细胞24h,无菌PBS洗涤细胞2次,胰酶消化后制成细胞悬液,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(Western blot)法观察各组细胞中磷酸化ERK、P38和JNK的表达。3.将16HBE细胞用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-4.0μmol/L)、NiS (2.0μmol/L)+FJD含药血清(低、中、高剂量组)处理细胞24h后,用免疫组化法检测各组细胞中核转录因子(NF-κB)κB的活性,并进行半定量分析,用RT-PCR法测定支气管上皮细胞中NF-κB P65的表达。本次实验采用SPSS13.0统计软件进行相关分析,多组间比较采用方差分析,两组之间的比较采用T检验,P<0.05被认为有统计学意义。结果1.当NiS的浓度为1-8μmol/L时,细胞的存活率均低于阴性对照组(MEM培养液),且NiS的浓度越高,细胞存活率越低,分别为93.6%、92.8%、90.3%、70.3%；低、中、高剂量FJD含药血清和空白血清对16HBE细胞均无毒性,细胞存活率分别为99.1%、98.8%、99.55%、98.7%。2.NiS能明显激活细胞ROS、MDA的表达(P<0.05),NiS的浓度分别为1.0、2.0、4.0μmol/L时,16HBE细胞中ROS分别为31.68、33.21、35.26 U/ml,且存在剂量-效应关系(r=0.813)；16HBE细胞中MDA分别为0.9518、1.0503、1.1620 nmol/ml,且存在剂量-效应关系(r=0.7926)。低、中、高剂量FJD血清与NiS (2μmol/L)共同处理16HBE细胞,ROS、MDA活性均低于染镍组(NiS为2μmol/L),尤其中、高剂量血清组作用显著(P<0.05),空白血清对16HBE细胞中ROS, MDA没有影响。NiS能明显抑制SOD、GSH-Px的活性(P<0.05),NiS的浓度分别为1.0、2.0、4.0μmol/L时,16HBE细胞中SOD分别为11.99、7.89、5.24 NU/ml,且存在剂量-效应关系(r=0.875)；同时16HBE细胞中GSH-Px分别为22.65、15.75、10.38 U/ml,且存在剂量-效应关系(r=0.829)。低、中、高剂量FJD血清与NiS (2μmol/L)共同处理16HBE细胞中,SOD、GSH-Px活性均高于染镍组(NiS为2μmo1/L),尤其中、高剂量血清组作用显著(P<0.05),空白血清对16HBE细胞中SOD、GSH-Px活性未见影响。3.NiS能明显激活细胞磷酸P38MAPK的表达,NiS浓度越高,磷酸化P38MAPK的表达值越高,阴性对照组细胞中磷酸P38MAPK为0.2868,NiS的浓度分别为1.0、2.0、4.0、5.0μmol/L,染镍组细胞中磷酸P38MAPK分别为0.4112、0.5937、0.6968、0.8976,FJD含药血清干预组中磷酸P38MAPK分别为0.5868、0.4972、0.4869,我们可以看出FJD含药血清抑制了磷酸化P38MAPK的表达,尤以中、高剂量组为甚(P<0.01),空白血清组对染镍细胞中磷酸化P38MAPK的表达没有明显影响(P>0.05)。NiS能明显激活细胞P-JNK的表达(P<0.05),NiS浓度越高,P-JNK的表达值越高,阴性对照组细胞中P-JNK为0.041,NiS浓度分别为1、2、4.0μmo1/L,染毒组细胞中P-JNK分别为0.057、0.062、0.068,而且存在剂量-效应关系(r=0.7736),FJD高剂量含药血清组和SP600125(10μmol/L) (P-JNK抑制剂)明显干预P-JNK的表达(P<0.05),空白血清组对染镍细胞中P-JNK的表达未见影响。NiS不能明显激活P-ERK1的表达(P>0.05),阴性对照组细胞中P-ERK1表达值为0.210,NiS浓度分别为1、2、4.0μmol/L,染镍组细胞中P-ERK1表达值分别为0.216、0.219、0.226,FJD低、中、高剂量含药血清组和P-ERK1抑制剂对磷酸化P-ERK1的表达无明显影响(P>0.05)。4.NiS能明显激活NF-κB和NF-κB P65的表达(P<0.05),阴性对照组细胞中NF-κB强阳性例数为8,NiS浓度分别为1、2、4.0μmol/L,染镍组细胞中NF-κB强阳性例数分别为17、22、29,而中、高剂量的FJD含药血清能下调NF-κB在16HBE细胞中表达(P<0.05)。阴性对照组细胞中NF-κB p65光密度比值0.8079,NiS浓度分别为1、2、4.0μmol/L,染毒组细胞中NF-κB p65光密度比值分别为0.8558、0.8950、0.9937,FJD含药血清干预组中NF-κB p65光密度比值分别为0.8938、0.8337、0.8119,中、高剂量的FJD含药血清能下调细胞中NF-κB P65光密度比值(P<0.05)。结论1硫化镍能明显诱导支气管上皮细胞中活性氧浓度升高、细胞脂质过氧化作用增强及细胞存活率降低,一定浓度的FJD含药血清能抑制染镍细胞中脂质过氧化作用、降低活性氧浓度。2硫化镍能明显激活细胞中磷酸化P38和JNK的表达,不能明显激活磷酸化ERK的表达,一定浓度的FJD含药血清对MAPK通路中细胞磷酸化P38和JNK有抑制作用。3硫化镍能明显激活细胞中NF-κB和NF-κB P65的表达,一定浓度的FJD含药血清能下调细胞中NF-κB和NF-κB P65的表达。4从细胞分子水平初步证明：扶正解毒汤对镍作业工人在防治癌症中可能有保护作用。