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罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii（以下简称绿僵菌）是一种广泛用于生物防治的昆虫病原真菌,且为研究虫生真菌的模式种。生物生长发育过程都会受到表观遗传修饰的影响,同时,表观遗传学的研究为大多传统遗传学难以解决的问题提供了新的思路。有研究表明,基因组DNA的甲基化参与了微生物正常生长发育的调控。而在生物生命活动的全部过程当中,蛋白质的磷酸化调节和去磷酸化调节都起着很重要的作用。近年虽然对丝状真菌的表观遗传研究较多,但对于基因组水平和蛋白质组学水平的研究相对较少;因此,本文从基因组DNA甲基化和磷酸化蛋白质组学两个表观遗传学方面对绿僵菌生长发育的两个重要阶段（菌丝和孢子）进行了研究,以期揭示基因组DNA甲基化和蛋白质磷酸化与绿僵菌生长发育的关系。首先,我们通过SMART RACE技术从绿僵菌菌株Ma73中克隆了两个甲基转移酶基因（GenBank登录号:MAA04944和MAA03836）的cDNA完整序列。序列分析表明,其中一个绿僵菌甲基转移酶MRDIM-2基因cDNA全序列为3911bp,5`非翻译区（5`-UTR）为168个核苷酸,3`非翻译区（3`-UTR）为242个核苷酸,开放式阅读框由3501个核苷酸组成,编码1166个氨基酸,成熟蛋白理论分子量为130.257kDa,理论等电点为7.64。另一个绿僵菌甲基转移酶MRRID基因cDNA全长为2686 bp,5`非翻译区（5`-UTR）为483个核苷酸,3`非翻译区（3`-UTR）为238个核苷酸,其开放式阅读框由1965个核苷酸组成,编码654个氨基酸,成熟蛋白理论分子量为73.913kDa,理论等电点为8.96。将绿僵菌MRDIM-2和MRRID基因编码氨基酸序列与其它物种的DNA甲基转移酶氨基酸序列进行同源比对,结果表明:15种甲基转移酶共聚成5个群,与绿僵菌MRDIM-2蛋白关系最近的为蛹虫草DIM-2,而与MRRID蛋白聚为一类则是蛹虫草DmtA蛋白和脉胞菌的RID蛋白。此外,进一步通过实时定量PCR技术,对绿僵菌菌丝（2天,纯菌丝）和孢子（15天,成熟孢子）的甲基转移酶基因进行差异表达分析,结果显示:相比菌丝体,孢子的两个甲基转移酶基因表达量呈下调的趋势,表明在孢子和菌丝的两个发育阶段DNA甲基化水平可能是不同的。第二,在前述实时定量PCR分析结果的基础上,本文进一步通过高通量亚硫酸盐测序技术对绿僵菌2天菌丝和15天孢子进行全基因组DNA甲基化测序分析,结果获得了绿僵菌单碱基分辨率全基因组DNA甲基化图谱,且菌丝和孢子的胞嘧啶甲基化水平分别为0.42%和0.39%。为了深入分析甲基化的功能,对两组样品全基因组差异性甲基化（DMR）区域进行GO和KEGG分析,发现在两组样品基因上游2kb和基因区内132个DMR区域中存在102个DMR基因,其中有55个基因与菌体生长的生物过程相关,9个基因是与细胞组分相关,28个基因是与细胞的分子功能相关;还得到了60种KEGG途径,其中包括氨基酸、糖类、脂肪酸代谢和ATP合酶等。为了研究DNA甲基化对基因转录表达的影响,选取22个菌丝和孢子全基因组DMR相关基因进行表达分析表明,适度的甲基化,在基因上游2kb区（in the promoter）或者同时位于上游2kb与基因区（overlap:promoter+gene body）,基因表现为高表达,而高或低的DNA甲基化水平的基因都趋向于较低的表达水平。但是,仅在基因区DNA甲基化水平的变化不能预测基因的表达。对基因上游2kb区或者同时位于上游2kb与基因区的102个DMRs相关基因中59个基因进一步的分析表明,在菌丝生长阶段,一些与能量合成必不可少的基因是中度甲基化和高度表达。如ATP合成酶基因（MAA04235）,乙酰-CoA乙酰基转移酶基因（MAA06480）。还有另外一些参与能量代谢的基因如MAA05759（蔗糖转运蛋白）,MAA02043（果糖-1,6-二磷酸酶）,MAA01615（葡萄糖氧化酶）和调节信号转导与G蛋白偶联受体基因如MAA01167（抑制蛋白）。第三,为了从蛋白质磷酸化方面分析表观遗传与绿僵菌生长发育的关系,本研究采用iTRAQ多重标记技术对绿僵菌两个不同发育阶段蛋白质磷酸化进行了研究。结果发现:在菌丝和孢子两个样品中获得了磷酸化肽段1487个,显著性差异蛋白磷酸化肽段数量为168个,其中包含116个蛋白;与孢子样品相比,菌丝有83个磷酸化肽段上调表达,85个下调表达。进一步通过GO分析菌丝和孢子之间差异蛋白的功能,在磷酸化肽段显著性差异的蛋白中代表了6种细胞组分功能（22.14%）、4种分子功能类型（28.78%）,参与6种生物过程（49.08%）。更进一步对孢子和菌丝样品差异蛋白进行通路注释并进行显著性分析,结果发现:菌丝与孢子差异蛋白显著富集于6种特异pathway通路（P<0.05）,也即真核生物核糖体合成,谷胱甘肽代谢,RNA转运,碳青霉烯类合成,苯乙烯降解和ABC转运。此外,分析参与代谢途径的蛋白,得出核糖体蛋白（lQQDAAAQSkPVkEEEDsEMEDQSPSELPPLAR）、着丝粒/微管结合蛋白（gEAGsDDDsDaAkGEAGsDDDsD）、WD重复包含蛋白（aDGNNtPtPQk）、5-羟脯氨酸酶（lGPGESVIIESPGGGGWGsE）、核糖核苷二磷酸还原酶（sGQsEDGDDSGER）蛋白、ABC转运蛋白（sVSsIALQk）在菌丝中呈上调表达,这些蛋白都参与核糖体的合成、谷胱甘肽代谢及细胞内物质转运,这与营养菌丝生长旺盛,而处于休眠期孢子的转录和蛋白合成较少、代谢低下是息息相关的。特别地,腈水解酶（vAssQPsPTRrssTFTDQGFEIALPSVSPtR）蛋白磷酸化在孢子中呈上调表达,说明该酶在绿僵菌孢子中产量高于菌丝。本文研究了DNA甲基化及蛋白质磷酸化在绿僵菌生长发育中的可能作用,发现了绿僵菌生长发育的两个典型阶段---菌丝和孢子的基因组DNA甲基化和蛋白质磷酸化存在显著性差异,得出显著性差异表达蛋白,揭示了这些差异蛋白在绿僵菌生长发育中参与的代谢调控作用,研究结果为进一步分析DNA甲基化和蛋白质磷酸化在丝状真菌生长发育过程中的潜在作用,同时也为丝状真菌的表观遗传学研究提供了理论基础。