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研究背景鼻咽癌（Nsopharyngeal carcinoma, NPC）是鼻咽上皮源性恶性肿瘤,发病具有明显的种族、地域特点,好发于中国南方诸省（如广东、广西、湖南）及香港、台湾、新加坡华人群体,发病率为10-50/10万人/年。而在我国北方地区与欧美人种中很少发生。高发区人群移居其它地区后,仍保持高发病率,并且10%的鼻咽癌患者有癌家族史等,提示遗传易感性和环境因素可能在鼻咽癌发病中起着重要因素。另外,NPC发病具有性别差异,在被调查人群中,男女患者比例通常为2-3：1。目前认为鼻咽癌是一种多基因遗传性疾病,涉及多个遗传易感位点,由遗传易感因素、EB病毒持续感染及环境因素等因素共同作用所致。MHC （Major histocompatibility complex）位于6p21.3区域,长约4Mb,占据0.13%的人基因组（3×109bp）,包含150多个基因,占据30000多个全部已知的蛋白编码基因的0.5%。许多MHC基因的产物是配体、受体、相互作用的蛋白质、信号因子和转录调控因子,涉及到适应性免疫反应中部分炎症反应、抗原的加工和递呈,以及天然免疫中部分NK细胞和细胞因子的相互作用。MHC又称人类白细胞抗原（HLA）复合体是目前所知最为复杂的调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统。HLA基因具有高度的多态性和广泛的连锁不平衡性,至今已报道有多种疾病与之相关,如类风湿性关节炎、骨关节炎、川崎病、强直性脊柱炎等等。白1974年以来,许多研究发现在HLA复合体中存在特定的HLA单体型或者基因与鼻咽癌有着潜在的关联。我们之前的meta分析显示在NPC高发地区人群中HLA分布特征不同于低发地区的。HLA复合体无疑在鼻咽癌遗传易感性中扮演重要角色,或者在调节抵抗EB病毒感染的天然和特异性免疫反应中有着重要作用,或者只是作为一个与易感位点紧密连锁的遗传标记。近期,两个研究组分别对台湾地区和华南地区鼻咽癌人群做了全基因组关联研究（Genome Wide Association Study, GWAS）,除了发现少数新的易感位点之外,都发现HLA区域存在主要的鼻咽癌易感位点。新一代测序技术的迅猛发展,为人们对疾病的认识,为疾病的预防、诊断及治疗提供了新的思路。外显子区域包含人体蛋白质的编码信息,涵盖了大部分与个体表型相关的功能变异。外显子仅占全基因组的1%,仅对外显子测序可以更加简便、经济、高效,可用于寻找单基因病、复杂疾病及癌症等的致病基因和易感基因的研究。用SureSelect靶向富集系统,可以只对感兴趣的基因区域进行测序,提高工作效率,降低花费,允许每次研究中检测更多的样品。同时对样品DNA量要求降低,使研究者可以使用更多的样本以满足统计学上的要求。目的基于MHC是鼻咽癌重要的易感区域,而人MHC基因组又比较复杂,我们利用安捷伦SureSelect靶向序列捕获系统,全面精细地捕获外显子和调控区域,以期找出功能相关的SNP位点,为进一步寻找鼻咽癌易感基因提供参考。方法1.利用靶向捕获系统结合高通量测序对MHC区域易感位点初步筛查（1）在安捷伦eArray网站上设计探针,并订制SureSelect靶向捕获试剂盒。（2）依照试剂盒说明书处理40例鼻咽癌样本DNA,然后在新一代高通量测序仪上测序。（3）将测序结果与40例来自千人基因组计划的中国北方汉族人的数据进行比对,运用生物信息方法发现差异SNP。2.用Sequenom MassArray系统对靶向捕获测序结果验证（1）第一阶段,用310例鼻咽癌病人和310例正常对照对靶向捕获测序发现差异的SNP进行初步筛选,发现有显著性差异的位点。（2）第二阶段,将这些有显著性意义的位点在另外一个独立样本上（768病例和759对照）进一步确认。（3）合并两次验证的数据进行分析,最终发现有显著性差异的位点。3.选取其中一个有意义位点进行功能初步研究（1）用生物信息学软件,如FastSNP （http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/pages/input novel.jsp）预测位点的功能。（2）提取鼻咽癌细胞株和鼻咽部组织DNA,用Sequenom MassArray系统结合测序进行SNP分型。（3）然后用real-time PCR检测不同分型的细胞、组织中的基因表达差异；western blot检测不同分型之间蛋白质表达差异。结果1.利用靶向捕获系统结合高通量测序对MHC区域易感位点初步筛查靶向捕获测序和序列比对后发现了9983个SNP位点存在于MHC区域的外显子及调控区,其中有约187个位点在病例和对照之间存在显著性差异,由于经费的限制我们挑选其中122个有意义的SNP位点进行进一步验证,这些位点分布于HLA-A、HLA-B、HLA-DQA1/DQB1、PSORS1C1等基因上2.用Sequenom MassArray系统对靶向捕获测序结果验证第一阶段对122个测序发现有差异的SNP进行分型,统计分析后有9个SNP具有统计学差异。第二阶段对这9个位点进行分型。对第一阶段和第二阶段分型数据进行综合分析,发现chr630280350（新位点）、rs1265053、rs1610696、chr631190425（新位点）、rs17604492具有显著性差异,P值分别为6.35E-14,2.61E-15,0.006398,0.006398,0.009038,0.0107；OR值分别为1.902（1.605-2.254）,0.6056（0.5347-0.686）,0.664（0.4938-0.8928）,0.662（0.4341-0.8911）,0.7386（0.5849-0.9328）,分别落在TRIM26、C6orf15、HLA-G、 PSORS1C1和NOTCH4基因上。3.Chr630280350位点影响TRIM26基因表达调控的初步研究（1）用生物信息学软件（FastSNP）预测结果显示：突变型（A）与野生型（T）结合的转录因子不同,突变型（A）有4个的转录因子结合（SRY、MZF1、STATx、C/EBP）,而野生型（T）只有一个转录因子结合（MZF1）。（2） Real-time PCR检测结果显示,AT位点的鼻咽癌细胞株C666-1较TT型的细胞株（CNE1、CNE2、SUNE15-8F、6-10B）中TRIM26的表达低（F=34.007,P<0.001）。（3）对组织进行分型得到9例AA/AT型和25例TT型,real-time PCR得到AA/AT组中TRIM25表达较TT组中低,t=-3.25,P=0.003。（4）Western blot检测不同分型的组织中TRIM26蛋白表达情况,发现AA/AT型较TT型蛋白表达降低。结论1.安捷伦SureSelect靶向捕获技术对MHC的捕获是确实可行的。通过比较得到187个差异性位点,有待于进一步验证。2.通过两个阶段的验证,我们发现了5个鼻咽癌候选易感位点,其中有2个新位点,它们是：TRIM26（chr630280350）, C6orf15（rs1265053）, HLA-G （rs161096）, PSORS1C1（chr631190425） and NOTCH4（rs17604492）.3.Chr630280350位点的突变型位点A有可能降低TRIM26的表达水平,进而增加鼻咽癌易感性。