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本研究通过设计和构建基因组结构与野生型APV-1病毒相同,但在APV-1晚期基因agno-1a翻译起始ATG有突变的新型重组病毒,来研究APV-1晚期基因agno-1a对该病毒晚期多顺反子翻译起始调控的机制。首先大量提取APV-1的cDNA病毒克隆pHL1003质粒DNA,用限制性内切酶AccI(部分酶切)和EcoRI(完全酶切)对质粒pHL1003进行分步酶切,得到pHL1003载体大片段。通过PCR的方法用含起始密码ATG点突变(ACG或CTG)的设计引物扩增目的小片段并用限制性内切酶AccI和EcoRI进行双酶切,然后连入pUC19载体中,以此准确获取含ACG或CTG的目的小片段。最后,用T4连接酶将突变目的小片段与pHL1003载体大片段相连接,构建能进行真核表达的重组cDNA病毒载体。将构建的含ATG突变的cDNA病毒载体质粒转染到鸡胚成纤维细胞后,用Western blot来检测重组病毒基因的蛋白表达变化。用限制性内切酶NdeI和NarI对质粒pHL1003-GFP和pHL1003突变体分别进行双酶切,获得所需要的载体大片段和目的小片段。再将突变目的片段(ATG→CTG;ATG→ACG)与pHL1003-GFP载体片段分别相连构建含报告基因EGFP的表达载体(即用GFP基因替代VPs基因)。通过转染鹌鹑胚成纤维细胞后使用荧光显微镜观察荧光表达量。结果表明,质粒pHL1003表达了VP1/2和Agno-1a三种蛋白,VP1为最大量的蛋白;质粒pHL1003-CTG也表达了Agno-1a和VP1蛋白,但VP1的数量和比例要比Agno-1a蛋白的表达量要少很多。三种APV-1 cDNA-GFP表达质粒转染鹌鹑纤维细胞后,pHL1003-GFP转染的细胞内荧光蛋白量较多。而质粒pHL1003-GFP-CTG和pHL1003-GFP-ACG转染鹌鹑胚纤维细胞后,细胞内荧光蛋白的表达量比pHL1003-GFP转染细胞的表达荧光蛋白量要少的多。因此,在APV-1晚期基因中agno-1a ATG突变明显影响着下游基因的翻译表达。这暗示了Agno-1a蛋白作为病毒晚期多顺反子基因的前导蛋白可能对其下游基因(GFP或VPs)的翻译表达起关键的调控作用。