近年的研究让我们对内含子的功能与意义有了更深的认识,但也提出了新的问题。实验表明内含子可以影响转录、mRNA的修饰、稳定性、出核运输和翻译效率等不同步骤的基因表达过程。想要深入了解内含子的这些作用,或许要从较宽广的角度来认识内含子的剪接机制。实验室前期结果表明大部分植物的内含子不能在酵母细胞中剪接,希望藉着探索从酵母到植物进化过程中影响内含子剪接的顺式元件和反式因子的相应变化,更深入地了解参与内含子剪接的要素。为了尽量保持待测目标基因的原有结构和生理功能,我们构建了一系列简化的拟南芥核糖蛋白RPL36B突变基因,转化至缺失内源酵母RPL36基因的细胞中,使得拟南芥核糖蛋白RPL36B成为细胞内唯一的RPL36蛋白来源,以便观察拟南芥突变基因在酵母细胞中的剪接效率及对细胞生长的效应。相关文献报道,内含子周围的序列、内含子GC含量及其周围外显子GC含量、启动子和snRNA及其相关蛋白等不同程度的影响内含子的剪接效率。基于上述分析,我们分别做了如下研究：首先,为了确定内含子周围序列对其剪接效率的影响,我们将一系列简化的拟南芥核糖蛋白RPL36B突变基因通过不引入酶切位点方式从5’非翻译区转移到编码区,通过分析RT-PCR检查,我们发现除了同时将5’剪接位点和分支位点突变成酵母的构建由完全剪接变为不完全剪接外,其余构建变化不明显。初步结果表明内含子周围序列对其剪接效率的影响不明显。接着,为了确定GC含量及其内含子周围的外显子GC含量对内含子剪接效率的影响,我们分别用高GC含量的酵母内含子和低GC含量的酵母内含子替换拟南芥第一个内含子,在此基础上同时还将其5’剪接位点单独突变与5’剪接位点和分支位点同时突变,然后通过RT-PCR检查,结果表明不同GC含量的酵母内含子都可以完全剪接。然而相对于拟南芥内含子,仅突变高或低GC含量的酵母内含子的5‘剪接位点仍可以发生部分剪接。但是同时突变5’剪接位点和分支位点后就变得完全不可以剪接；可能5’剪接位点和分支位点对内含子剪接起关键作用,GC含量对其影响不明显。为了对影响内含子剪接因素有个更系统的了解,我们进一步分析不同启动子对内含子剪接效率的影响,将一些构建的启动子由酵母RPL36B启动子换成ADH1启动子或将其原先低拷贝载体换成高拷贝载体后,通过RT-PCR验证分析还是不可以剪接,说明最重要的可能还是内含子的识别因素决定其能否剪接,启动子对其影响效果不明显。最后,从影响内含子识别的snRNA方面研究内含子的剪接,U1 snRNA主要是通过碱基互补配对识别内含子5‘剪接位点,U2 snRNA主要是通过碱基互补配对识别内含子分支位点,内含子5‘剪接位点和分支位点的协同识别对其剪接有关键作用。鉴于拟南芥和酵母内含子剪接位点保守性的差异,推测拟南芥U1和U2 snRNAs在剪接位点识别的过程中有更高的可塑性,尤其在分支位点。于是我们希望在酵母细胞中导入拟南芥的U1和U2 snRNAs,看是否能促进拟南芥内含子在酵母中的剪接。我们将克隆的拟南芥U1 snRNA或U2 snRNA,分别转入到B,B+3M和5M,5M+3M等剔除内源36B的突变菌中,通过Spotting assay和RT-PCR的检测发现单独转入U1或U2snRNA还是不能改进拟南芥内含子在酵母细胞中的剪接。我们已经通过设计针对拟南芥特异性的反转录引物和PCR引物确定转进后拟南芥U1 snRNA和U2snRNA确实发生了转录,可能是仅仅依靠U1 snRNA和U2 snRNA还不足以促进其剪接,还需要一些剪接相关的蛋白。我们克隆了拟南芥特异性的蛋白P14、SF1和SF3B155,将其转进去希望在snRNA的协同作用下能够促进内含子的剪接。同时,我们也计划构建拟南芥和酵母的cDNA文库,希望从中筛选一些能够促进拟南芥内含子剪接的相关因子。从拟南芥内含子在酵母细胞中剪接所需要的额外顺式及反式元件,我们可以更深入地了解内含子剪接从酵母到植物进化的机制和意义。