前言　　肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是由汉坦病毒引起的一种历史悠久、流行广泛、危害性严重的自然疫源性疾病。该病的主要临床特征有发热、出血和肾损害，其病理改变包括微血管出血、急性血小板减少、低血压休克以及肾衰竭等。目前，我国HFRS的发病率和病死率仍居世界首位，是重灾区。HFRS具有如此高的发病率及病死率，但发病机制尚未完全清楚。在汉坦病毒的感染中，免疫细胞及其表面相关标志物的研究不容忽视。　　病毒感染人体后能导致感染细胞功能和结构的损害，另一方面也能诱发人体的免疫应答和各种细胞因子的释放。自然杀伤细胞是天然免疫系统的主要组成部分，免疫反应中可显著地发挥抗病毒作用。NK细胞是一群CD3表达阴性、CD56表达阳性或CD16表达阳性的淋巴细胞，具有较强的杀伤功能和免疫调节功能。NK细胞表面受体包括杀伤抑制受体和活化受体。这些受体能够与靶细胞表面相应的配体相结合而产生抑制信号或活化信号，决定着NK细胞是否对靶细胞发挥杀伤功能。　　CD8+T细胞是介导细胞免疫的效应T细胞，经抗原致敏后可以特异性杀伤携带致敏抗原的靶细胞，通过其表面的受体TCR和CD8分子同抗原提呈细胞提呈的MHC-肽复合物结合从而传导活化信号，进而对靶细胞进行杀伤。同时，有研究表明，CD8+T细胞也可表达一些抑制性或活化性的NK相关受体。但目前对于HFRS患者体内CD8+T细胞表面NKR的表达情况，报道较少。　　因此，本实验对HFRS患者不同临床阶段NK细胞亚群的精细划分、特定NK细胞亚群表面受体的表达，HFRS患者体内CD8+T表面NKR的表达情况进行深入研究，以期为阐明HFRS患者的免疫机制、寻找有效地疾病防御防控措施提供依据。　　方法　　一、实验标本采集　　按照2008年修订的“全国流行性出血热防治方案”(WS278-2008)中临床诊断及分型标准，所有病例经特异性HFRS—IgM、IgG检查均为阳性，临床表现典型。阴性的健康对照者来自健康体检门诊和实验室工作人员，血常规、肝、肾功能正常，无免疫系统疾病史。在患者知情并同意的情况下抽取外周血5ML肝素钠抗凝。同时对健康人群以同样的方法取血作对照。　　二、淋巴细胞分离　　1)取5ml抗凝全血与5mlPBS缓冲液，加入10ml人淋巴细胞分离液离心20分钟，取中间白色云雾状狭窄层（PBMC层），放入4-5mlPBS缓冲液的试管中，离心10分钟。吸去上清液，沉淀经过反复洗涤2次即得所需淋巴细胞。　　2)将分离淋巴细胞置于液氮罐中保存以备后续分析。　　三、细胞复苏　　从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化，将细胞悬液移入离心管中，缓慢加入1640培养液，离心两次，去除二甲基亚砜。　　四、细胞表面染色　　向流式细胞仪专用试管中加入0.1mlPBMC悬液，按照BD公司细胞表面染色试剂盒说明书操作分别加入相应的抗体，并设立单标管与阴性对照管。染色半个小时后加每管加入2mlPBS缓冲液进行洗涤，离心10分钟，用缓冲液重悬细胞，流式细胞仪进行检测。　　五、流式细胞检测　　为保证实验准确性，检测机器的准确性，然后再对之前制备好的样本进行测定，用流式分析软件对数据进行分析。　　六、统计学分析　　使用SPSS11.0统计分析软件进行统计。样本采用独立样本t检验对数据做统计分析。　　实验结果　　一、HFRS患者NK细胞变化　　HFRS患者的NK细胞水平明显高于正常对照组，并且具有统计学差异。对四个不同临床发病阶段的患者同正常对照组进行比较分析发现，在四个发病阶段内两种细胞水平也都处于升高状态，且少尿期高于发病初期与末期。　　二、HFRS患者NK细胞活化与抑制受体表达变化　　对NK细胞抑制受体NKG2A和活化受体NKG2D进行了分析。结果患者抑制受体NKG2A表达总水平有下降趋势，并且在少尿期下降的比较明显。但是NK细胞活化受体NKG2D表达有上升的趋势。对不同发病阶段患者活化受体表达进行比较发现少尿期略有升高。　　三、HFRS患者NK细胞亚群变化　　对HFRS患者NK细胞的3个NK细胞亚群进行检测，发现所有患者的CD56-CD16+和CD56briCD16-/+NK亚群细胞数量显著高于正常对照组，并且在都少尿期升高明显，而CD56dimCD16+细胞NK亚群没有明显的变化。对各期变化趋势进行分析时，结果同样是没有差异。　　四、HFRS患者CD8+T细胞以及其表面表达NK受体的变化　　首先选取标记CD3+的T淋巴细胞，再定义出CD3+CD8+T细胞，结果为患者CD8+T细胞整体水平显著升高，整个病程中的CD8+T细胞水平升高的都很明显。但是HFRS患者与正常对照CD8+T细胞表达NK受体(活化受体NKG2D和抑制受体NKG2A)并没有太大的差异。　　结论　　HFRS患者NK细胞数量在疾病的发热期和少尿期显著增加。NK细胞活化受体NKG2D表达量总体水平上升，抑制受体NKG2A表达下降，在少尿期最少。NK细胞CD56-CD16+和CD56briCD16-/+细胞亚群发生变化，在疾病的少尿期变化明显，CD8+T细胞增多，尤其在少尿期表现的更为明显。