猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是造成猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine,MPS)的主要病原,感染此病原的猪在临床上主要表现为干咳,日增重和饲料转化率降低等症状,给养猪业带来了巨大的经济损失。同时由于猪群感染该病原后呼吸道黏膜受损,容易引起其它病原的继发感染而造成较高的死亡率。为有效控制该病原的流行,通过早发现来进行净化是最好的方法。酶联免疫吸附试验(Enzyme-1inked immunosorbent assay,ELISA)是检测血清中抗体最常用的方法,其中阻断ELISA方法因为不会受到其它杂蛋白的干扰而具有相对较高的特异性。本实验室前期利用酵母展示技术鉴定出了Mhp的P97蛋白上主要抗原区P97CR1。本研究根据P97CR1基因序列设计合成特异性引物,通过PCR方法获得该目的片段,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中获得重组原核表达载体pET28a-P97CR1,利用原核表达系统对该蛋白进行表达纯化。纯化后的P97CR1蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫6周龄的BALB/c小鼠,当小鼠血清效价达到1.28×10~5后分离免疫后小鼠的脾细胞,并与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法对阳性杂交瘤细胞株进行筛选,最终获得了一株分泌抗P97CR1蛋白单抗的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3分泌的MAb的重链为IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析显示该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。利用A3杂交瘤细胞株制备该单抗的腹水,并对腹水中的单抗进行纯化和HRP标记,采用间接ELISA方法测得腹水和HRP标记抗体的效价均为5.1×10~5。将P97CR1蛋白作为包被抗原,用HRP标记单抗作为二抗初步建立了Mhp抗体阻断ELISA检测方法,在建立该方法优化各种条件时发现:抗原最佳包被浓度为20 ng/ml;5%脱脂乳为最佳封闭液;待检猪血清最佳稀释倍数为2倍;HRP标记的单抗最佳稀释倍数16000倍;最佳封闭时间、血清作用时间、HRP标记单抗作用时间和TMB底物作用时间分别为120min,60min,30min和10min;根据51份阴性血清检测结果确定该方法的判定标准:当样品PI值≥44.94%,判为阳性;样品PI值≤38.86%,判为阴性;38.86%<样品PI值<44.94%,判为可疑,当实验结果为可疑时,需要重新检测1次,若仍为可疑,则判为阳性。特异性试验结果显示只有Mhp阳性血清具有较高的抑制率,而猪鼻支原体(Mhr)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪链球菌(SS)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胸膜肺炎(APP)和多杀性巴氏杆菌(PM)阳性猪血清没有阻断效果,证明该方法具有较好的特异性。该方法的批内和批间重复性实验的变异系数均小于10%,显示较好的重复性。并且该方法与商品化IDEXX试剂盒的符合率达到91.2%。这些结果表明本论文的研究成果为将来开发具有广泛推广前景的Mhp阻断ELISA抗体检测试剂盒奠定了坚实的基础。