四氢嘧啶是一类多产于嗜盐菌、起到平衡细胞内渗透压作用的相容性溶质,因其抗逆保护作用而在实际应用中得到高度关注,在化妆品工业、酶制剂领域和医药行业有很强的应用前景。本文研究的盐单胞菌Halomonas hydrothermalis Y2分离自造纸废液,能够在废液中高盐强碱的环境下占据生存优势,这种耐盐碱的机制使得该菌株具备了利用海水实现无灭菌连续发酵生产工业产品的潜能。本研究通过H.hydrothermalis Y2基因组分析,发现其中存在着四氢嘧啶合成及代谢的基因簇,随后推测出了 Y2内四氢嘧啶的合成及降解通路;通过ectA的敲除验证了其四氢嘧啶的合成通路,敲除菌株表现出四氢嘧啶合成能力的丧失及高盐耐受性下降,表明四氢嘧啶在Y2高盐的耐受方面起了重要作用。基于MG培养基中的NaC1、葡萄糖(G1c)、谷氨酸钠(MSG)和pH对种子及发酵培养基进行了优化,确定了 4%NaCl,1%葡萄糖,1%谷氨酸钠为种子优化的最佳组合;在发酵培养基优化过程中,发现盐浓度和pH为影响四氢嘧啶产量的两个主要因素,Y2在四氢嘧啶生产过程中对于高盐高pH具有依赖性,最终确定10%NaCl,pH 9为发酵生产四氢嘧啶的最优条件。为提高Y2中四氢嘧啶合成量,通过查阅文献并结合H.hydrothermalis Y2菌株的基因组测序结果,对其中的四氢嘧啶代谢途径相关基因进行分析并对四氢嘧啶水解酶基因doeA和羟化酶基因ectD分别进行了敲除。在单独敲除ectD后其四氢嘧啶产量提高了 16%,而将ectD和doeA同时敲除之后产量提升了 63.8%,表明Doe所在代谢通路为H.hydrothermalis Y2内四氢嘧啶降解的主要通路。此外,在双突变体H.hydrothermalisY2/△ectD/△doeA的发酵后期仍能检测到四氢嘧啶产量的下降,推测Y2内可能仍存在着其他未知的四氢嘧啶降解途径。在课题组前期研究的基础上对H.hydrothermalis Y2基因组中两个Na+/H+逆向转运蛋白NhaD2、Mrp,分别进行了单敲及双敲探究其对菌株耐盐性的影响。结果表明,高pH的发酵条件下,敲除NhaD2之后,菌体生产四氢嘧啶的盐依赖性并没有下调;而敲除mrp后,最适盐浓度下调了 20 g/L且突变体四氢嘧啶产量与H.hydrothermalis Y2/△ectD/△doeA相当;将NhaD2和mrp均敲除之后,发酵生产四氢嘧啶的最适盐浓度下调的同时其产量也有所降低。这进一步证明了在pH9时,mrp型Na+/H+逆向转运蛋白对于菌体的耐盐性起到了主要作用,因此H.hydrothermalis Y2/△ectD/△doeA/△mrp被确定为下调盐依赖性高产四氢嘧啶的生产菌株。此外,本研究在1 L发酵罐进行了H.hydrothermalis Y2、H.hydrothermalis Y2/△ectD/△doeA、H.hydrothermalis Y2/△ectD/△doeA/△mrp 分批发酵的发酵能力比较,经过48 h发酵,三株菌的最高四氢嘧啶产量分别为:5.5 g/L、7.2 g/L和7.2 g/L。在发酵过程之中均可以观察到菌体的二次生长,mrp三突变体由于其发酵所需盐浓度相对较低,在发酵前期生长速度最快,Glc和MSG也迅速消耗,这表明较低的NaCl有利于菌株的生长,同时不会影响mrp三突变体中四氢嘧啶的产量。在发酵后期双突变体和mrp三突变体较原始菌株Y2而言,由于四氢嘧啶代谢通路的阻断,导致四氢嘧啶降解率的下降。为了进一步提高H.hydrothermalis Y2/△ectD/△doeA/△mrp的四氢嘧啶产量,将菌株在含有0.5 L MMG培养基的1L发酵罐中培养,在发酵过程中进行分批补料,培养基的初始NaCl浓度为20 g/L,在发酵18 h后增加至60 g/L,MSG浓度维持在20 g/L左右,通过转速和通气的调节培养基中的溶氧高于30%。发酵前期菌体快速生长,在18 h时达到了最大的生物量,整个过程中没有观测到菌体的二次生长;在48 h时四氢嘧啶的总量达到最高10.5 g/L,在整个发酵过程中,总共消耗了 50 g MSG,其生产四氢嘧啶的转化率为0.21 g/g。在发酵后期检测到胞内四氢嘧啶的下降,结合此时生物量下降等因素,推测是由于菌体的衰亡导致四氢嘧啶从胞内释放至了培养基中。