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【研究背景】癌症是对人类健康影响最大的重要疾病之一,大量研究表明,癌症的发生受基因和环境因素的共同作用,其中基因因素包括基因突变,本实验室一直致力于研究基因突变与癌症发生发展的关系,SHP-2突变是本实验室主要研究的对象之一。SHP-2（Src homology region 2-（SH2-）containing protein tyrosine phosphatase 2）是PTPN11编码的非受体型酪氨酸磷酸酶蛋白,它包含2个SH2（Src homology-2）结构域和蛋白酪氨酸磷酸酶催化结构域（protein tyrosine phosphatases,PTPs）,生理状态下,N端SH2结构域与PTP结构域结合,抑制了SHP-2磷酸酶活性,但是当SH2结构域与其他磷酸化底物结合时,其与PTP结构域的结合会减弱或消失,从而使PTP激酶的结构域暴露出来,从而让酪氨酸磷酸酶活性的作用发挥出来。SHP-2在调节细胞信号转导及控制细胞活性中有着重要的作用,它的激活不仅与努南综合征（NS）等血液系统恶性疾病的发生相关,而且和多种实体肿瘤的产生密切相关。本实验室的前期研究也发现,SHP-2突变不仅促进了乳腺癌细胞的恶性转化,还促进了结肠炎相关的结直肠癌的发生,在此过程中还诱导了细胞EMT（Epithelial-mesenchymal transition）的发生。另外通过查阅数据库也发现,在多种实体瘤中均检测到有SHP-2的突变,其中,肺癌中SHP-2的突变率占0.87%。并且根据世界卫生组织WHO发布的世界癌症报告显示,肺癌是近几年来世界上发生率最高,也是死亡率最高的癌症。但目前,对SHP-2突变与肺癌关系的研究并不多。基于以上背景知识,为了探讨SHP-2激活突变是否能促进正常的肺细胞发生恶性转化,进而导致肺癌的发生,以及SHP-2是如何促进正常支气管上皮细胞恶性转化的,我们将SHP-2野生型和E76K突变的质粒转染到人正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）中,筛选出稳定细胞株,然后通过体外实验检测其恶性生物学行为的变化,并做进一步的相关机制研究。另外通过向实验室现有的SHP-2E76Kneo+/+的小鼠肺内用滴鼻的方式滴入腺病毒Cre载体,特异性使小鼠肺内的SHP-2E76K基因激活发挥作用,从而进行体内实验,检测小鼠的肺癌发生情况及肿瘤的数量、大小、转移情况等。【研究方法】1.将本实验室保存的SHP-2野生型（WT）,E76K突变型的质粒进行测序并比对鉴定其序列的正确性。2.用SHP-2野生型,E76K突变型及空载的质粒转染到BEAS-2B细胞中,筛选出稳定表达SHP-2 WT,SHP-2E76K,SHP-2 NC的BEAS-2B细胞系。3.用构建成功的稳定细胞株进行生物学行为相关实验,检测SHP-2E76K突变对BEAS-2B细胞的影响。1流式细胞术用于分析转染前后BEAS-2B细胞的周期变化。2平板克隆实验检测BEAS-2B细胞集落形成能力的变化。3软琼脂集落形成实验检测BEAS-2B细胞的非锚定生长情况。4 Transwell实验检测BEAS-2B细胞的迁移及侵袭能力的改变。4.用Western blot检测ERK,p-ERK蛋白及EMT相关的钙黏蛋白（E-cadherin,N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表达情况。【研究结果】1.SHP-2E76K和SHP-2 WT质粒鉴定结果显示其序列正确。2.成功转染并筛选出了稳定表达SHP-2E76K,SHP-2 WT及SHP-2 NC的BEAS-2B细胞系,并且发现在蛋白水平SHP-2E76K突变及SHP-2野生型（WT）过表达的BEAS-2B细胞中SHP-2的表达是增高的。3.流式细胞术检测到SHP-2E76K突变的BEAS-2B细胞S期比例是增加的。4.SHP-2E76K突变的BEAS-2B细胞的集落形成及非锚定生长能力、迁移及侵袭能力均明显提高。5.SHP-2E76K突变促进了BEAS-2B细胞ERK通路的磷酸化蛋白表达,还降低了上皮样Marker的表达并增加了间质样Marker的表达。【结论】SHP-2E76K突变促进了BEAS-2B细胞的恶性转化,这一过程中有ERK信号通路的激活,且促进了BEAS-2B细胞EMT的发生。