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神经母细胞瘤与胚胎期的运动神经元杂交,形成了运动神经元样细胞系,其中NSC34细胞株既克服了原代运动神经元培养的费时、费力、花费高等不足,又保留了原代运动神经元的特征,是研究肌萎缩侧索硬化(ALS)的常用细胞株。TDP43是一个无所不在的由1号染色体编辑的TARDNA结合蛋白,分子量为43KDa。2006年,在额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化的泛素阳性的包涵体中发现TDP43。由此,TDP43在变性疾病中的作用引起了高度关注。TDP43正常存在于细胞的胞核内,但是在死于ALS的病人的中枢神经系统中,TDP43由胞核内转移至了胞质内,并弥散分布于泛素阳性的包涵体内。近两年在不同的散发性肌萎缩侧索硬(SALS)和家族性肌萎缩侧索硬化(FALS)中先后发现了TARDBP(transactive response DNA binding protein)基因的30种突变。TARDBP基因很可能是继SOD1基因后发现的又一种ALS的高突变基因。本课题在观察稳定转染不同TDP43对NSC34细胞影响的基础上,加入EGCG观察EGCG对于稳定转染TDP43 Q331K细胞的作用。第一部分四种稳定转染不同TDP43的NSC34细胞系的培养及其LDH的变化目的:探索稳定转染不同TDP43的神经元样细胞株NSC34细胞的培养方法及其LDH变化,为进一步研究TDP43与肌萎缩侧索化的关系和肌萎缩侧索硬化的防治创造条件。方法:使用稳定转染Empty vector、TDP43 Wide type、TDP43 Q331K、TDP43 M337V四个NSC34细胞系。此四种细胞系由本实验室构建,采用脂质体将四种不同的TDP43转入运动神经元样细胞株NSC34细胞,参考培养NSC34细胞株的方法进行培养,采用抗生素加压筛选,进而挑选单克隆细胞,采用荧光免疫技术鉴定,将单克隆细胞系进行培养、传代、并置于液氮中冻存。将稳定转染Empty vector、TDP43 Wide type、TDP43 Q331K、TDP43 M337V四个NSC34细胞系各一支从液氮中取出,擦酒精后拿入培养室,于37℃水浴箱中晃动使之迅速融化,移至离心管中,加入含10%血清的DMEM培养基,离心,去上清,加入含10%血清的DMEM培养基重悬为单细胞悬液,接种于25cm2一次性塑料培养瓶。将瓶盖旋至半松状态,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。将成功培养稳定转染TDP43 NSC34细胞传代,接种于24孔细胞培养板内,接种密度10000/孔,于传代24小时后倒置显微镜下观察,细胞形态恢复,突起明显,生长状态良好,换液,再待细胞恢复24小时后,收集各组培养液及细胞,测定乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:成功培养了稳定转染Empty vector、TDP43 Wide type、TDP43 Q331K、TDP43 M337V四个NSC34细胞系。使用胰酶消化细胞,并以25万/瓶密度接种,2-3天后细胞80%～90%融合,倒置显微镜下观察细胞生长状态良好。稳定转染TDP43 Q331K、TDP43 Wide type和TDP43 M337V细胞系较Empty vector细胞系的LDH水平显著增高,P<0.05,具有统计学意义。稳定转染TDP43 Q331K细胞系的LDH水平较稳定转染Empty vector、TDP43 Wide type和TDP43 M337V细胞系的LDH显著增高,P<0.05,具有统计学意义。结论:稳定转染TDP43 Wide type、TDP43 M337V细胞系的LDH水平较空Empty vector细胞系的LDH水平升高,说明此两种基因型的TDP43对细胞存在一定氧化损伤,此结果与之前文献报道一致。稳定转染TDP43 Q331K细胞系的LDH水平较稳定转染TDP43 Wide type细胞系明显增高,间接反映了其对细胞损伤程度更明显,提示TDP43 Q331K这种突变型TDP43与野生型TDP43的功能不同,并且对NSC34细胞产生了更严重的氧化细胞损伤。第二部分EGCG对稳定转染的TDP43 Q331K NSC34细胞系的影响目的:研究EGCG对稳定转染TDP43 Q331K NSC34细胞系的作用,为进一步探索EGCG预防和治疗肌萎缩侧索硬化的作用。方法:将成功培养的稳定转染TDP43 Q331K NSC34细胞传代,接种于96孔细胞培养板内。接种密度3000/孔,传代24小时后倒置显微镜下观察可见细胞形态恢复,突起明显,生长状态良好。更换新的培养液,再待细胞恢复6-12小时后,将细胞随机分为对照组和EGCG干预组。选用5μmol/L EGCG作用48小时,作用完全后收集各组培养液,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:稳定转染TDP43的NSC34细胞系在给予EGCG5μmol/L作用48小时后,倒置相差显微镜下观察,细胞形态未见明显变化。给予EGCG 5μmol/L作用48小时后,细胞的LDH较未干预组明显下降,具有统计学意义(P<0.05)。结论:EGCG对于抵抗细胞的脂质过氧化损伤发挥了一定作用,进而发挥神经保护作用。EGCG在肌萎缩侧索硬化(ALS)等神经变性疾病的防治上具有一定的应用前景。