乳腺癌是欧美国妇女最常见的恶性肿瘤，约占美国癌症发病率的31.5％和癌症死亡率的18.4％。我国尽管不是乳腺癌的高发地区，但也呈逐渐上升的趋势，并已成为妇女常见恶性肿瘤的第二位，约占全身恶性肿瘤的7％～8％，近年来，在我国北京、上海等一些大城市已成为女性健康的头号杀手。在乳腺癌临床治疗中，内分泌治疗和化疗有着与手术和放疗同等重要的地位，对于一些老年和晚期病例的治疗，更有其特殊的作用。多年来，随着对雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)等常规以外的肿瘤标志物(c-erbB-2/neu、pS2等)的检测，指导乳腺癌化学内分泌治疗和预测预后等，使内分泌治疗疗效和选择性更高，进一步巩固了化学内分泌治疗的地位。但是甾体受体基因的突变与变异、化学内分泌治疗的耐受以及如何对乳腺癌预后和疗效预测中的“多联”检测项目进一步优化等新的问题，促使我们深入到基因水平对乳腺癌生物学特性作进一步的研究。 本研究在ER、PR蛋白检测的基础上，增加了pS2、Hsp70和ST13基因检测，分析分子标记之间及其联合检测与乳腺癌患者生存的相关性；并以反义核酸技术在基因水平研究Hsp70和ST13对乳腺癌生物学特性的影响。 第一部分：乳腺癌ER、PR、pS2、Hsp70和ST13基因的表达及其与生存相关性研究 1．ST13单克隆(ST13McAb)的制备：用本所建立的ST13杂交瘤细胞株1F2经常规培养至生长良好，接种BALB/c小鼠腹腔诱生腹水，腹水MoAb以饱和硫酸铵沉淀法纯化。 2．本院93～94年有随访资料和完整蜡块的乳腺癌病例45例作ER、PR、pS2、Hsp70和ST13免疫组化检测。结果：乳腺癌患者各分子标记表达的阳性率相近，ER最高为77.8 浙江大学搏士学位论文 ％，Hsp70和 ST13最低，分别为 622％和 64．4％。 3．本组乳腺癌患者各分子标记表达的相关性分析中，ER、PR、PSZ和ST13的表达之间 有直接或间接的正相关性，其中ST13与三者均呈显著正相关，且ER与ST13和ER与PR之 间的相关性非常显著（p．000）。此外，临床病理预后因子中 LN（＋》4和绝经后状态之 间则显著负相关性（尸＜005）。 4．KaplanMeier生存率曲线及二。g Rank显著性检验发现，分子标记物中仅ST13和 HSp70阳性者明显提高5年生存率（尸 no．05）。而LN（＋）＜4和绝经后状态也同样提高 乳腺癌患者的5年生存率，分别为尸 no．01和尸 no．05。 CO X生存分析也发现盯13和k叨0阳性者有统计学意义（尸t 0．05）：LN（十 》4降 低和绝经后状态提高5年生存率的统计学意义均为临界（分别为P ＝＝0．052和P ＝＝0．056）， 而其它分子标记均无统计学意义。 第二部分：反义 Hsp70真核表达重组质粒的构建 1．H平70－pGEM－T Easy原核表达重组质粒构建：用 RT－PCR方法得到 375hp HSp70片 段产物（cDNA），经回收和过柱纯化，与仟犯M－T Eap质粒连接成重组质粒（Hp70W－T Eap），经DNA测序证实。 2．反义阿7ppcDNA3．l（＋）重组质粒构建：将物704亚M－T Eap原核重组质粒 经 EcoRI酶切，l二％琼脂糖凝胶电泳回收及过柱纯化，与 eDNA3．1（＋）反向连接，构成 反义 Hsp70－pcDNA3（＋）真核表达重组质粒，并经 DNA测序证实。 第H部分：Hsp70、ST13反义核酸分别转染乳腺癌细胞后的生物学特性研究 1．将H印70、ST13反义核酸重组质粒及peDNA31（＋）分别以脂质体（Lipofecti） 介导法转染乳腺癌B。p－盯细胞，经G418筛选，得3柱转染细胞（ASHSP－BCaP、ASSTdsCap 和 pcDNAM。ap），以 PCR和 WpstSYY BI叭鉴定。结果，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实 AsHspq3cap细胞和AsSTdscap细胞分别有522hp和653hp的相应条带；Western Blot证实 AsHspffi。ap细胞中Hsp70和AsSTffi。p细胞中ST13表达均明显降低。 2．对转染细胞的生物学特性研究发现：ASHSpds。叩细胞生长缓慢，细胞DNA电泳中有 典型的DNA凋亡梯度条带，细胞周期分析有特征性亚GI峰；ASSTHCap细胞则生长加快， FCM检测中发现S期比例升高。在对化疗药物阿霉素（AI）M）敏感性的检测中发现，AsHsp－－Bcap 28 浙江大学博士学位论文 细胞在ADM低浓度（0．IH M．l．0 p M和5．0 p饲）时敏感性高与Bcap－37对照组（P＜0．05）， 而ASSTdsCap细胞对AI）M的敏感性与对照组相近。 结论： ①ER、PR、pSZ、H甲70和 STI3在乳腺癌细胞中表达量均较丰富，其中 ER、PR、pSZ 和 STI3表达之间有一定的正相关性，而H印70则可能是一个?