凝血Ⅷ因子是凝血级联反应中极为重要的一种凝血因子,凝血Ⅷ因子的缺乏将导致患者凝血功能障碍,引起血友病。目前血友病的治疗主要通过补充体内不足的凝血Ⅷ因子,以维持患者体内正常Ⅷ因子的水平。基因工程为人类治疗血友病提供了绝佳途径,使用基因工程方式能够获得充足的人凝血Ⅷ因子。人凝血Ⅷ因子全长2332个氨基酸,由于其肽链全长较长,且人凝血Ⅷ因子mRNA不稳定、翻译后的蛋白非正常折叠、转运过程中与内质网中的免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin-binding protein,BiP)的结合、内部含有沉默子等因素的影响,使得其在宿主细胞内的表达量较低。研究表明,Ⅷ因子内某些位点氨基酸的突变、BiP结合区域内某些氨基酸的突变(如F309S或F309A)、以及BiP结合区域外糖基化位点的优化等方式可提高Ⅷ因子的分泌表达。本实验室前期结果也发现在BiP结合区域附近的某些位点可以影响Ⅷ因子的分泌表达。本实验在实验室原有研究的基础上,选择在FⅧ A1结构域中BiP结合区域外的E287位点,P290位点及H311位点进行突变。通过将突变质粒瞬时转染到293T细胞中,72 h后裂解细胞,使用蛋白免疫印迹检测胞内FⅧ表达量,使用Coamatic试剂盒检测分泌到胞外的FⅧ活性,以及对表达EGFP的细胞量的统计计数,结果表明,P290T,E287D,E287H这三种突变的胞内FⅧ表达效率没有明显提高,但是胞外Ⅷ因子活性相对WT-BDD-FⅧ提高了近2倍。提示这些突变可能提高了分泌到细胞外的FⅧ的比活,也可能通过改变FⅧ的结构,使得分泌到细胞外的FⅧ的量更多。