肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内高发的恶性肿瘤之一,其中50%发生在中国,发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重威胁着公共卫生健康。目前,临床上针对肝癌主要采取的治疗手段包括手术、化疗、放疗和免疫疗法等。手术治疗一般适用于早期肝癌患者且易引起创伤,放化疗存在着严重的毒副作用和耐药等问题,免疫治疗的响应率较低,因此寻求安全高效的治疗方式对肝癌患者具有重大意义。纳米递药系统（Nano drug delivery systems,NDDSs）不仅可以改善药物在体内的分布,有效降低其毒副作用,还可以通过对载体材料进行功能化修饰达到肝癌靶向治疗的目的。然而,现有的NDDSs仍存在靶点部位药物释放缓慢及不完全的现象,因此促进药物在靶点快速完全释放是提高肝癌疗效需要解决的关键问题之一。刺激响应型纳米递药系统是指在外源性（电场、磁场、超声波、温度）或内源性（p H、酶、氧化还原微环境）的刺激下,递药系统的结构发生改变,自动调节靶部位药物的释放速率,以实现刺激响应型药物释放行为。其中,温度敏感性聚合物胶束递药系统已成为研究热点,其优势在于一方面通过温度变化使聚集在肿瘤区域的药物从聚合物胶束中快速完全释放,提高了药物疗效;另一方面,通过高温杀伤肿瘤细胞,同时对肿瘤进行热疗。本研究利用上临界溶解温度型（Upper critical solution temperature,UCST）聚合物胶束递药系统的相关特性,结合抗肿瘤药物、光热、光动力、免疫治疗等联合治疗方式,借助多种成像技术实现可视化引导下的肝癌精准治疗。主要内容如下:第一部分:利用自由基聚合反应合成UCST为43℃的聚（丙烯酰胺-丙烯腈）,将聚乙二醇化学嫁接到聚（丙烯酰胺-丙烯腈）上,得到聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）,进一步通过唾液酸化学修饰得到唾液酸-聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）。唾液酸-聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）可在水性介质中自组装形成胶束,临界胶束浓度（Critical micelle concentration,CMC）为28.9μg/m L。采用热分解法合成兼具光热转换效应和磁共振/光声双模态成像功能的纳米钆-硫化铜（Gd-CuS NPs）,其平均粒径为13.2±2.31 nm,电位值为-18.0±3.32 m V,且在980 nm处有较强的吸收。以水难溶性药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）为模型药物,Gd-CuS NPs为光热成像剂,先后采用透析法和乳化溶剂挥发法制备唾液酸修饰共载DOX和Gd-CuS NPs聚合物胶束（SPDG）,其粒径为202.0±19.8 nm,且呈规则均一的球状。SPDG具有良好的负载能力,对DOX的载药量和包封率分别为3.54%和77.4%,对Gd-CuS NPs的负载量为6.61%。SPDG经980 nm激光照射后,具有明显的升温效应,在高温刺激下药物快速完全释放,表现出与游离药物相近的扩散速率。此外,SPDG在体外具有增强磁共振T1成像信号和明显的光声成像信号,且与浓度呈良好的线性关系。以人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2为模型细胞,空白聚合物胶束在体温和高温（43℃）处理后细胞存活率均在85%以上,显示出良好的生物安全性。以未经唾液酸修饰共载DOX和Gd-CuS NPs聚合物胶束（PDG）为对照,HepG2细胞对SPDG显示出更好的摄取行为。采用游离唾液酸阻断HepG2细胞表面E-选择素受体后,HepG2细胞对SPDG的摄取量显著降低,表明SPDG肝癌细胞内的主动转运是由唾液酸与E-选择素特异性结合介导的。此外,SPDG在细胞水平上具有温度敏感性药物释放特征,当SPDG被HepG2细胞摄取后经980 nm激光以2W/cm~2的功率照射5 min,DOX可迅速释放并进入细胞核内,有效提高了药物的作用效果。相比于接受单独化疗或光热治疗组,化疗联合光热治疗组能显著抑制肝癌细胞活性,引起细胞凋亡,同时上调调亡蛋白caspase-3的表达并降低抗凋亡蛋白bcl-2的表达,说明化疗联合热疗的方案对肝癌细胞有最强的抑制效果。采用皮下注射HepG2细胞的方式构建荷瘤裸鼠模型。静脉注射后,唾液酸修饰聚合物胶束可通过唾液酸与肝癌细胞表面高表达的E-选择素受体特异性结合,有效富集在肿瘤部位且注射后24 h蓄积量最高。荷瘤裸鼠静脉注射SPDG后,在肿瘤部位观察到明显的磁共振和光声成像信号,说明SPDG在体内具有良好的磁共振/光声双模态成像效果,可以实现对肿瘤部位的实时成像;注射24 h后,小鼠肿瘤部位的双模态成像信号最为明显,SPDG组磁共振和光声信号分别为PDG组的1.33倍和1.12倍,进一步验证SPDG具有更好的肝癌靶向能力。SPDG组荷瘤裸鼠经980 nm激光以2 W/cm~2的功率照射6 min,肿瘤组织局部温度可升高至43℃,促使药物在肿瘤部位快速完全释放,具有显著的肿瘤生长抑制效果,抑瘤率高达91.7%,且观察到肿瘤组织有明显的坏死和凋亡现象。治疗观察期间,除游离DOX组外,其他治疗组裸鼠的体重较为稳定,主要器官未发生病理损伤,说明SPDG的体内安全性良好。第二部分:小分子靶向药物联合免疫疗法被认为是治疗肝癌晚期最有效的手段之一,该方案已获FDA突破性疗法认定。长期服用小分子靶向药物易出现副作用大、无肿瘤靶向聚集、口服生物利用率低等问题。免疫治疗过程中,由于肿瘤细胞在免疫逃逸过程中多表现为低免疫原性,造成肿瘤抗原难以被体内的免疫细胞识别,降低了免疫治疗的响应率。针对上述问题,本研究在前期工作基础上以聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）为载体材料,制备了肝癌特异性靶向肽SP94修饰的共载仑伐替尼（Lenvatinib,LEN）和近红外二区（NIR-Ⅱ）荧光探针IR-1061-Acridine（IR-1061-Ac D）聚合物胶束（SPLI）,通过小分子靶向药物、光热、光动力联合作用杀伤肝癌细胞的同时,诱导细胞发生免疫原性死亡（Immunogenic cell death,ICD）以增强其免疫原性,有效激活体内抗肿瘤免疫反应,进一步与抗PD-1（a PD-1）抗体联用,促进a PD-1的抗肿瘤活性,实现NIR-Ⅱ荧光成像引导下多种方式联合的高效抗肿瘤效果。在前期基础上合成了肝癌特异性靶向肽SP94修饰的聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）,该聚合物在水性介质中可自组装形成胶束,临界胶束浓度为32.2μg/m L,且该胶束具有温度敏感性,其UCST为43℃。以IR-1061和吖啶为原料合成了兼具光热和光动力效应的NIR-Ⅱ荧光探针IR-1061-Ac D,核磁共振氢谱、质谱确证IR-1061-Ac D的成功合成,其最大吸收波长（1075 nm）和发射波长（1175 nm）均在NIR-Ⅱ区域。构建共载SP94修饰LEN和IR-1061-Ac D的聚合物胶束,所得的SPLI呈规则均一的球形,粒径为212.0±7.3 nm。SPLI具有良好的负载能力,对LEN的载药量为7.68%,包封率为84.5%,对IR-1061-Ac D的负载量为4.94%。经1064 nm激光照射后,SPLI在体外具有较好的光热转换效应和单线态氧产生能力,同时表现出明显的温度敏感性药物释放特征,即在37℃下药物释放速率缓慢且释放不完全,而经激光照射后的药物释放速率显著提高。SPLI在体外具有良好的NIR-Ⅱ荧光成像效果,与负载ICG聚合物胶束（SP/ICG）相比,在8 mm组织深度下,荧光强度仍显著高于背景信号强度,具有更深的组织穿透深度。以小鼠正常肝细胞AML-12和肝癌细胞H22作为模型细胞。空白聚合物胶束在体温和高温（43℃）处理后,细胞存活率均高于90%,说明其作为药物载体具有良好的生物安全性。以未经SP94多肽修饰共载LEN和IR-1061-Ac D聚合物胶束（PLI）为对照,在SP94多肽的介导下H22细胞对SPLI显示出更好的摄取行为。SPLI被H22细胞摄取后经1064 nm激光以1 W/cm~2的功率照射4 min后,细胞内有单线态氧产生,且随着照射时间延长,单线态氧的产生水平也随之提高。SPLI在细胞水平上呈现出温度敏感性药物释放特征,经激光照射后药物在细胞内迅速释放,通过小分子靶向药物、光热、光动力联合治疗方式显著抑制肝癌细胞活性并引起最大程度的细胞凋亡,同时有效诱导肿瘤细胞发生ICD,与免疫细胞进行共孵育后,发生ICD的肝癌细胞可以有效促进树突状细胞（Dedritic cells,DCs）的成熟及抗原提呈,T淋巴细胞被有效激活。通过后肢皮下和肝组织原位注射H22细胞的方式分别建立荷皮下瘤和荷肝原位瘤小鼠模型。NIR-Ⅱ荧光成像结果显示,与PLI组相比,SPLI在两种荷瘤小鼠肿瘤区域具有更多的分布和蓄积,荷皮下瘤和荷肝原位瘤小鼠分别在静脉注射后24 h和6 h肿瘤部位的蓄积量最大。荷肝原位瘤小鼠的术中成像过程中可清晰显示出肿瘤组织并能够被完全切除、无残余灶。荷皮下瘤小鼠接受SPLI经1064 nm激光以1 W/cm~2的功率照射12 min,肿瘤局部温度升高至43℃,聚集在肿瘤部位的药物得以快速完全释放,进一步联合a PD-1抗体,通过小分子靶向药物、光热、光动力和免疫治疗作用联合抑制了原发肿瘤和远端肿瘤的生长,同时,小鼠原发肿瘤组织发生ICD的程度最高,显著刺激DCs的熟化,进一步引起T细胞的激活和增殖。远端肿瘤和脾脏组织中的辅助性T细胞（Helper T cells,Th）、细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTLs）、效应记忆T细胞（Effector memory T cells,MTCs）的比例和抗肿瘤细胞因子的含量均有所升高,而调节性T细胞比例降低,证明了该联合治疗方案可以有效调控肿瘤微环境并激活全身免疫系统,同时抑制了肝癌细胞肺转移的发生。治疗观察期间,各组荷瘤小鼠体重变化较小,主要脏器均未发生显著的病理损伤,说明SPLI的体内安全性良好。本研究所构建的UCST型聚合物胶束递药系统可实现药物的肝癌靶向递送和可控释放,通过多手段联合治疗模式发挥更为显著的肝癌抑制效果。借助成像技术,准确追踪递药系统的实时治疗过程,为开发可视化引导下肝癌精准治疗奠定了一定的基础。