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目 的1.研究线粒体呼吸链和ATP、ROS等对HIF-1α的稳定积聚的影响。2. 探讨缺氧时HIF-1对 Glut-1和GK及ATP产生的影响。材料和方法大鼠肝BRL细胞,以DMEM培养基加小牛血清培养,分别分为正常对照组(21%O2)(常氧组),缺氧组(1%O2),各常氧和缺氧加阻断剂组(碘乙酸、鱼藤酮、抗霉素A、叠氮钠、2,4-二硝基苯酚),常氧和缺氧分别加ATP、H2O2、谷胱甘肽组,常氧加吲哚美辛组、缺氧组和缺氧加吲哚美辛组,缺氧4h。收获细胞,分别行Western Blot 检测各组的HIF-1α、Glut-1和GK蛋白;荧光检测二乙酸二氯荧光素测定各组的细胞内ROS产生;高效液相色谱法检测ATP和能荷;免疫荧光法检测细胞内HIF-1α的表达和核转位。RT-PCR检测各组的Glut-1和GK的mRNA含量。酶学方法检测GK的活性。结 果分别于常氧(21%O2)和缺氧(1% O2)条件下以由低到高不同浓度鱼藤酮、抗霉素和叠氮钠阻断线粒体呼吸链复合体I、III和IV 4h,Western Blotting检测HIF-1α蛋白,结果表明,缺氧时随各阻断剂浓度的增高,细胞内HIF-1α蛋白量逐渐减少到基本无表达;常氧情况下阻断线粒体呼吸链复合体I、III和IV,与未阻断一样,无HIF-1α蛋白稳定积聚。与常氧(21%O2)对照组相比,缺氧(1%O2)4h时细胞ATP和能荷明显降低;常氧下采用碘乙酸阻断糖酵解或分别以鱼藤酮、抗霉素和叠氮钠阻断呼吸链复合体I 、III 、IV 4h,细胞ATP和能荷较对照组明显降低;缺氧时采用碘乙酸阻断糖酵解或分别以鱼藤酮、抗霉素和叠氮钠阻断呼吸链复合体I 、III 、IV 4h,细胞ATP和能荷均较单纯缺氧明显降低。常氧情况下细胞有一定的ROS产生,缺氧4h时细胞的ROS产生减少,缺氧并应用碘乙酸阻断糖酵解或分别以鱼藤酮、抗霉素和叠氮钠阻断呼吸链复合体I 、III 、IV 4h,细胞ROS产生更加减少。Western Blot 检测,BRL细胞常氧下HIF-1α仅微量表达,检测呈阴性,缺氧4h时其表达明显增加,缺氧同时以不同的浓度碘乙酸阻断糖酵解,BRL细胞的HIF-1α产<WP=11>生稳定与单纯缺氧相比较无明显改变。在常氧(21%O2)和缺氧(1% O2)条件下应用2,4-二硝基苯酚使氧化磷酸化解藕联,BRL细胞ATP和ROS产生减少。常氧(21%O2)时应用2,4-二硝基苯酚低浓度时对HIF-1α无影响,高浓度时可诱导HIF-1α的稳定积聚。在缺氧(1% O2)条件下低剂量应用2,4-二硝基苯酚,使HIF-1α产生被抑制,高剂量时HIF-1α的产生增加。在常氧(21%O2)和缺氧(1% O2)条件下分别在细胞培养液中加入H2O2、ATP和谷胱甘肽对HIF-1α产生无明显影响。免疫荧光检测表明,常氧(21%O2)时细胞有微量HIF-1α表达并核转位。缺氧(1% O2)时HIF-1α的稳定积聚增加,并大量核转位;缺氧(1% O2)时应用吲哚美辛抑制HIF-1α稳定积聚,细胞内HIF-1α含量和核转位明显减少。RT-PCR检测表明,单纯缺氧(1% O2)BRL细胞内Glut-1和GK的mRNA较常氧(21% O2)时明显增加。Western Blot检测表明,单纯缺氧(1% O2)BRL细胞内Glut-1和GK蛋白量较常氧(21% O2)时明显增加。缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制HIF-1α稳定积聚后Glut-1和GK的mRNA增加受抑制。缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制HIF-1α稳定积聚4h后,Glut-1和GK蛋白增加受到抑制。缺氧(1% O2)后GK活性明显增强。缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制HIF-1α稳定积聚4h后GK的活性较单纯缺氧对照组降低。缺氧(1% O2)时BRL细胞ATP产生减少,缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制HIF-1α稳定积聚4h时ATP 较对照组降低。结 论在大鼠肝细胞(BRL),细胞单纯缺氧时HIF-1α积聚和稳定反应需要具有完整功能的线粒体呼吸链的支持。在大鼠肝细胞(BRL),缺氧时ATP和ROS的量改变不是HIF-1α积聚和稳定的原因,缺氧时此两者的改变可能只是伴随状态。缺氧时HIF-1可以诱导Glut-1和GK的转录和表达。抑制HIF-1α的稳定积聚时,可以减少缺氧时其调控的Glut-1和GK的表达,并抑制GK在缺氧时增强的活性,影响糖酵解和细胞能量的产生。