第一部分大鼠原位左肺移植模型的建立和改进【目的】建立并改进大鼠原位左肺移植动物模型【方法】清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只,体重200-250g。气管插管呼吸机支持下,经肺动脉灌洗LPD液后获取左肺,套管完成后保存于LPD液中备用。受体的手术采取不断肌肉的侧胸切口,肺门结构的游离采取钝性分离。肺门三结构的吻合采用套管法套入。【结果】所有的供肺套管均顺利完成,移植手术成功45例,失败5例,成功率90%。供肺获取及套管时间25±2min,吻合时间30±4min。失败的原因:3例肺静脉套管失败,1例肺动脉套管失败,另一例为术中大出血休克死亡。【结论】成功建立并改进了大鼠原位左肺移植的动物模型。该动物模型容易复制,成功率高,有进一步推广的价值。第二部分供肺保存过程中细胞死亡类型的动态变化【目的】研究供肺保存过程中细胞死亡类型的动态变化【方法】清洁级健康雄性SD大鼠42只,体重200-250g。分为7组,每组6只。气管插管呼吸机支持下,经肺动脉灌洗LPD液后整体获取心肺。将心肺整体取出后立即置于4℃新鲜制备的LPD液中保存一定的时间(0,2,4,6,12,18,24小时)。在不同的供肺保存时间点上,经主肺动脉向供肺内灌注台盼蓝进行染色并固定。蜡块上同时进行TUNEL和Hoechst染色。在荧光显微镜下观察,严格按照盲法由两位研究者对死亡细胞进行分类计数。【结果】随着供肺保存时间的延长,细胞逐渐出现死亡。在早期,细胞死亡以凋亡为主,在供肺保存12小时左右细胞的凋亡达到最高峰,占所有细胞的9.17±2.17%。此后细胞凋亡逐渐下降,在供肺保存18小时组基本消失,整个变化呈现钟形曲线;而细胞的坏死始于供肺保存4小时组,以后逐渐上升,至供肺保存24小时组达到最高峰33.0±2.87%,整个变化呈现向上的抛物线型。【结论】在供肺的保存过程中,肺实质细胞的死亡在供肺保存的早期以凋亡为主,后期以坏死为主。细胞的坏死是随着供肺保存时间的延长而逐渐增加的。第三部分供肺保存及移植肺TLR4信号系统的激活【目的】通过对供肺保存和肺移植两阶段的Toll-like receptor 4(TLR4)及其下游炎症因子的表达的检测,探讨TLR4与肺移植后缺血再灌注损伤的关系。【方法】清洁级健康雄性SD大鼠42只,体重200-250g。分为7组,每组6只。供肺的获取和保存同前一部分。将心肺整体取出后立即置于4℃的新鲜制备的LPD溶液(100ml LPD液中加入0.7ml 1%碳酸氢钠溶液将其PH值调整到7.40)中保存。在不同的供肺保存时间点上(0、2、6、8、12、18、24h),Western blot方法检测供肺的TLR4蛋白表达水平,RT-PCR方法检测其下游因子TNF-α和iNOS的表达水平。另取SD大鼠42只,体重250-300g。分为7组,每组6只。供肺的获取和保存同前一部分。在不同的供肺保存时间(0、2、6、8、12h)后,在改良的模型上行左肺原位移植术。移植术后30 min,Western blot方法检测供肺的TLR4蛋白表达水平,RT-PCR方法检测其下游因子TNF-α和iNOS的表达水平。对供肺保存过程中的细胞坏死的变化和YLR4的表达做相关性分析。【结果】供肺保存过程中TLR4表达随着保存时间的推移逐渐的增加,在供肺保存24小时达到最高.其动态变化和细胞坏死规律一致。供肺保存过程中的细胞坏死和TLR4的表达密切的相关(r=0.874,P＜0.01)。不同保存时间点的供肺炎症因子(TNF-α和iNOS)的表达逐渐升高,与其相应的TLR4表达水平呈现正相关(TNF-α,r=0.779,P＜0.01;iNOS,r=0.769,P＜0.0 1)。肺移植后TLR4及其炎症因子TNF-α、iNOS的表达与相应保存时间的供肺相比显著增加,其表达量随着供肺保存时间的延长而逐渐增加。肺移植后30 min的TLR4表达水平与炎症因子TNF-α和iNOS的表达密切相关(TNF-α:r=0.617,P＜0.05;iNOS;r=0.460,P＜0.05)。【结论】大鼠供肺的保存过程中存在TLR4及其下游炎症因子的的活化,呈时间依赖性,其变化趋势与供肺保存过程中发生的细胞坏死的情况相一致。肺移植后,移植肺TLR4及其下游炎症因子的表达与肺保存期相比显著增加,且与供肺保存时间的长短密切相关。第四部分PDTC干预对移植肺TLR4信号系统表达和肺功能的影响【目的】通过吡咯二硫氨基甲酸酯(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)阻断TLR4的下游炎症因子的释放,从分子水平、组织水平和移植肺功能评估等方面来考察TLR4信号系统的阻断在大鼠的缺血再灌注损伤中是否具有保护作用。【方法】SD雄性大鼠30对,体重在200-300g之间。分为两组,对照组和PDTC干预组。每个组又按供肺的保存时间分为0h、2h、6h、8h和12h共5个亚组。每个亚组行六次成功的肺移植实验,收集实验标本。对照组供肺保存于LPD液中,实验组的保存液中加入PDTC(Sigma公司,40mmol/L)。移植术后30 min,Western blot方法检测两组供肺的TLR4蛋白和P50表达水平,EMSA方法检测NF-κB入核的变化。RT-PCR方法检测其下游因子TNF-α和iNOS的表达水平。同时比较两组气道压力、血气分析氧和指数、湿干重比、HE染色、透射电镜等肺功能指标。【结果】PDTC干预组和对照组相比,TLR4和P50的表达统计学检验均无显著差异(TLR4-p=0.66 1,p＞0.05;P50:p=0.276,p＞0.05)。PDTC干预组和对照组相比,NF-κB入核明显的减少,其差别统计检验有显著意义(P=0.000,P＜0.01);,TNF-α和iNOS表达统计学检验有显著差异(P=0.000,P值均＜0.01)。PDTC干预组与对照组相比较,移植肺的NF-κB入核减少和TLR4下游的炎症因子TNF-α、iNOS表达上的变化密切相关(TNF-α:r=0.636,P＜0.01;iNOS:r=0.633,P＜0.01)。观察移植肺功能,PDTC干预组和对照组相比,肺移植后30 min气道峰压差(P=0.038,P＜0.05)、血气分析氧合指数(P=0.042,P＜0.05)、湿干重比(P=0.001,P＜0.05)、移植肺的肺损伤评分(P=0.017,P＜0.05),统计学检验均有显著差异。【结论】PDTC预处理不能降低移植肺的TLR4的表达,但是可以阻断TLR4信号系统下游炎症因子的释放。其机制可能通过阻断NF-κB的入核来实现的,而非下调NF-κB的表达量。细胞因子水平的下降与术后的移植肺功能的改善明显相关。因此,PDTC预处理能明显改善移植肺的功能。