植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒致病机理的重要工具。获得了侵染性cDNA克隆，可利用反向遗传学方法分析病毒基因在病毒复制、局部和系统移动、症状发展及病毒与寄主因子互作等过程中的作用，进而可以获得弱毒株系用来保护植物免受强毒株系的危害。植物病毒侵染性cDNA克隆也可以改造为超表达载体和病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing, VIGS）载体，可用来生产医用、兽用疫苗和抗体，也可用来研究植物基因功能。烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），可以由蚜虫以非持久性方式传播传播。近几年来，TVBMV在我国烟草上的发生呈上升趋势，给烟叶生产造成严重的经济损失。本研究获得了TVBMV侵染性cDNA克隆，验证了TVBMV弱毒突变体的交叉保护效果，并将TVBMV侵染性克隆改造为植物病毒超表达和VIGS载体。主要具体结果如下：（1）利用经典5’RACE获得了TVBMV HN39分离物的全长5′-UTR。TVBMV HN39的5′-UTR由171个核苷酸（nt）组成，包含多数马铃薯Y病毒属病毒包含的高度保守序列区域boxA（ACAACAU）和boxB（UCAAGCA），比以前测定的多了25个nt。（2）构建了能分别用基因枪和农杆菌浸润接种的TVBMV侵染性克隆。在TVBMVHN39分离物的P3基因3’端、CI基因的5’端和3’端分别插入一个内含子，将其克隆到插入了35S启动子的pUC19载体上，获得质粒pTVBMV。利用基因枪将pTVBMV接种本氏烟（Nicotiana benthamiana）、三生烟（N. tabacum cv. Samsun）和亮黄烟（N. rustica），发病率为100％，说明pTVBMV有非常高的侵染性；pTVBMV在这三种寄主上的症状和病毒积累量均与野生型TVBMV一致。将携带内含子的TVBMV基因组克隆到质粒pCambia0390的SalⅠ和SmaⅠ之间，获得了能利用农杆菌浸润的侵染性克隆pCamTVBMV。通过融合PCR在TVBMV NIb和CP基因之间插入了GFP基因，得到pCamTVBMV-GFP；利用pCamTVBMV-GFP可在紫外灯下观察病毒在本氏烟中的移动。（3）利用TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV-GFP分析了HC-Pro调控病毒致病力、抑制RNA沉默活性和协生的关键氨基酸位点。突变体IQI（IQC-IQI）、ART（NRT-ART）、R182I（FRNK-FINK）、D198K（CDN-CKN）和DEN（IQN-DEN）在本氏烟上的症状明显减轻，ELISA检测不到病毒的存在但荧光定量RT-PCR检测结果为阳性，说明该位点的突变影响了病毒的致病力、复制和翻译水平；突变体PAK（PTK-PAK）和APS（NPS-APS）引起的症状和野生型病毒一致，但症状出现的时间比野生型病毒的晚2天；而突变体EITC（RITC-EITC）、AGS（NGS-AGS）和SQN（IQN-SQN）对TVBMV的症状无影响，接种这三个突变体的本氏烟植株中病毒积累量与野生型病毒一致。农杆菌共浸润实验和协生实验表明，显著降低病毒致病力的5个突变位点基本丧失了RNA沉默抑制活性及与PVX的协生作用。这说明TVBMV HC-Pro的这些位点同时参与调控病毒的致病力、协生和抑制RNA沉默活性。（4）测定了含有单位点、双位点和三个位点突变的弱毒突变体的交叉保护效果，证明间隔期10天以上交叉保护效果更好。在本氏烟上，单个位点突变体DEN表现为轻微的花叶症状；双位点突变体DEN+D198K引起轻微的脉明症状；而三位点突变体DEN+D198K+ART无明显症状。交叉保护实验表明，接种双位点突变体DEN+D198K10天以后进行挑战接种交叉保护效果最好。（5）构建了TVBMV的超表达载体和VIGS载体。在pCamTVBMV衣壳蛋白（Coatprotein, CP）基因上游和下游分别插入多克隆位点（MCS-1和MCS-2），疫霉菌的Elicitin基因克隆到多克隆位点MCS-1，能够在注射区域观察到Elicitor引起的过敏性坏死反应（Hypersensitive reaction, HR），说明该载体可用于外源蛋白的表达。在TVBMV弱毒株系DEN的CP基因上游和下游多克隆位点（MCS-1和MCS-2），将其改造成VIGS载体。将GFP基因插入到TVBMV VIGS载体的多克隆位点MCS-1，在接种后第10天能够系统沉默16c的GFP基因，说明该载体可用于植物基因功能研究。