论文部分内容阅读
目的:本研究主要是选择急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞株NB4细胞中异常高甲基化的WNT信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因为靶点,从表观遗传学的DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰两个方面,探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As203)治急性早幼粒细胞白血病(APL)可能的表观遗传学机制;通过对As203作用NB4细胞前后DNA甲基转移酶、组蛋白甲基化酶、组蛋白去甲基化酶表达差异的检测,分析三氧化二砷调控DNA和组蛋白甲基化可能的作用机理;并通过对As203作用NB4细胞前后β-catenin、Survivin基因、cyclin-D1基因以及C-myc基因表达差异的检测,进一步分析三氧化二砷对WNT信号通路下游重要靶基因表达影响;从而比较完整的从DNA甲基化和组蛋白甲基化的表观遗传学层面阐释三氧化二砷影响NB4细胞WNT/β-catenin信号通路发挥抗APL作用的可能机制。方法:1.采用CCK-8法检测As203对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞存活率的影响;Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测As203作用NB4细胞前后凋亡率;流式细胞仪检测As203作用NB4细胞前后细胞周期百分率;采用重亚硫酸盐测序聚合酶链反应(bisulfite sequencing polymerase chain reaction BSP)联合TA克隆测序方法,定量分析不同实验组三氧化二砷作用前后NB4细胞株其WNT信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因DNA启动子区甲基化水平的变化,并通过与MSP、焦磷酸测序相比,探讨BSP优缺点;2.采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunopreciprtation assay CHIP)技术检测As203作用NB4细胞前后WIF-1、DDK3、HDPR1基因启动子区组蛋白H3K9单甲基化、二甲基化和三甲基化的水平;采用荧光实时定量PCR法(q RT PCR)检测As203作用NB4细胞前后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B,H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39a、G9a,H3K9组蛋白去甲基化转移酶JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C和JMJD2D,进一步探讨三氧化二砷对NB4细胞WNT通路抑制基因组蛋白H3K9甲基化和DNA甲基化影响的可能的机制。3.采用荧光实时定量PCR法(q RT PCR)检测As203作用NB4细胞前后WNT/β-catenin信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因,WNT信号转导通路重要调节蛋白β-catenin以及WNT信号通路下游重要靶基因Survivin、cyclin-D1和C-myc m RNA的表达,比较完整的从组蛋白甲基化和DNA甲基化的表观遗传学层面阐释As203影响NB4细胞WNT/β-catenin信号通路发挥抗APL作用的可能机制。结果:1.不同浓度As203作用NB4的细胞后,NB4细胞增殖抑制率随时间和浓度增加而显著升高;细胞凋亡比例也逐渐增加,24 h、48 h以早期凋亡为主,72h细胞以中晚期凋亡为主;细胞周期24 h、48 h以G2/M期增加的较为明显,72 h有轻度的G0/G1期增加。2.经过BSP联合TA克隆测序方法检测发现,As203处理NB4细胞后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,WIF-1、DDK3、HDPR1基因甲基化率进行性下降,甲基化程度明显减弱。通过与MSP、焦磷酸测序相比,用BSP具有较高的甲基化状态检出率,且方法较为简单,重复性较强,能准确检测目的基因片段中各Cp G位点的甲基化情况,对分析Wnt信号通路抑制基因甲基化状态具有较高的特异性和敏感性。3.经过q RT PCR检测发现,As203处理NB4细胞后,As203处理NB4细胞前后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,HDPR1基因的m RNA相对表达量呈上调趋势,甲基转移酶DNMTl、DNMT3A、DNMT3B的表达呈下降趋势。4.采用CHIP检测发现,As203处理NB4的细胞后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,WIF-1、DDK3和HDPR1基因启动子区的组蛋白H3K9me3均有不同程度的下降,以HDPR1基因明显;而H3K9me1,2表达不受影响。经过q RT PCR检测发现,As203作用NB4细胞后,随着浓度的增加,作用时间延长,H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39a、G9a的m RNA相对表达量呈下调趋势,其中G9a m RNA的下调更为明显;同时H3K9组蛋白去甲基化转移酶JMJD2D m RNA的表达上调,而JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C表达不受影响。5.经过q RT-PCR检测发现,As203作用NB4细胞后,随着药物浓度的增加,干预时间的延长,β-catenin表达水平明显下调,同时,survivin、c-myc和cyclin-D1表达也随之下降,与未处理组细胞相比差异有统计学意义。结论:1.As203能够明显的抑制急性早幼粒细胞白血病NB4细胞的生长和增殖,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,细胞凋亡率随之逐渐增加,而且使细胞周期阻滞于G2/M期;2.As2O3能逆转急性早幼粒细胞白血病NB4细胞WIF-1、DKK3、HDPR1基因启动子区的DNA异常高甲基化和下调WIF-1、DKK3、HDPR1基因启动子区的H3K9 me3甲基化水平而使表达受抑的肿瘤抑制基因WIF-1、DKK3、HDPR恢复表达;3.BSP具有较高的甲基化状态检出率,且方法较为简单,重复性较强,能准确检测目的基因片段中各Cp G位点的甲基化情况,对分析Wnt信号通路抑制基因甲基化状态具有较高的特异性和敏感性,可广泛应用于筛选不同类型标本基因启动子甲基化分析;4.As203可能通过抑制组蛋白甲基化酶SUV39a和G9a和DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达来逆转组蛋白和DNA的高甲基化;5.As203通过下调组蛋白和DNA甲基化基础上,可能通过组蛋白-DNA循环反馈机制,进一步下调组蛋白和DNA甲基化水平;6.通过下调组蛋白甲基化酶SUV39h1的表达来减少PML-RARa/SUV39h1复合物形成,抑制H3K9甲基化,促进基因转录表达,促进血细胞分化。7.通过下调DNA甲基转移酶DNMT1和组蛋白甲基化酶G9a的表达来减少DNMT1-UHRF1-G9a复合体形成,抑制H3K9甲基化,促进基因转录表达。8.As203处理NB4细胞后,随着药物浓度的增加,干预时间的延长,c-myc和cyclin-D1表达水平明显下调,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。