Saframycins是1977年由Arai等人从Streptomyces Lavendulae中分离得到的一类双四氢异喹啉化合物，它具有强烈的抗肿瘤活性、抗菌活性和独特的作用机制，其结构类似物Ecteinascidin743已经在欧洲和美国进入Ⅱ/Ⅲ期临床试验阶段，极有可能成为一种新型抗肿瘤化疗药物。本课题首先围绕李磊克隆获得的saframycin A生物合成基因簇展开研究，在序列分析的基础上推测出其多肽骨架合成机制-saframycin A的肽链骨架是在非核糖体肽合成酶的催化下由丙氨酸、甘氨酸和两分子酪氨酸衍生物缩合而成的。我们在体外表达纯化了与之相关的三个完整的NRPS蛋白(ORF16、ORF17和ORF18)，并通过NRPS蛋白同位素底物测活实验证实了我们关于骨架形成机制的推测。在这一推测中我们还大胆提出了非线性的NRPS(ORF18)重复催化两次酪氨酸衍生物延伸的设想，为了对其加以验证进行的蛋白体外催化骨架形成的测活实验也已取得重大进展。多肽骨架环合成为异喹啉的结构以后还需要氧化还原、甲基化等一系列的后修饰才能形成完整的化合物分子，为了研究其后修饰途径、确定参与肽链骨架后修饰的七个氧化还原酶(ORF3、ORF5、ORF8、ORF12、ORF14、ORF15和ORF31)的催化顺序和生化机制，我们对这七个氧化酶进行了体外表达，相应的纯化和测活实验正在进行中。　　 第二部分的研究工作围绕着阿进霉素(Azinomycin B)的多肽骨架生物合成机制展开。Azinomycin B具有良好的体内抗肿瘤活性和潜在的体外细胞活性，这一系列显著活性与其独特的分子结构关系密切，Azinomycin B分子结构中密集包含了一系列非天然官能团，包括一个萘甲酯片断、一个2-氨基-1，3-二羰基片断、一个环氧丙烷片断以及一个在现在已知天然化合物中独一无二的5，3-氮杂并环片断。我们对其多肽骨架的生物合成机制进行了推测。Azinomycin B独特的骨架结构是由五个NRPS模块共同催化形成的。AziAl首先识别和激活一个3-甲氧基-5-甲基-萘甲酸盐并将它转移至AziA2上，下游AziA3识别激活α-酮异戊酸，将它还原成α-羟基异戊酰，并与萘甲酸盐缩合，紧接着AziA4催化了复杂氨基酸氮丙啶[1，2a]吡咯烷基氨基酸的延伸，最后AziA5在完成苏氨酸的延伸催化后，以它的RE结构域将多肽还原成醛并解离下来，形成了Azinomycin B的骨架。为了研究其独特的多肽骨架形成机制，我们以赵师姐克隆获得的Azinomycin B生物合成基因簇为基础，在体外表达和纯化了三个负责其骨架形成的完整的NRPS蛋白(AziAl、AziA4和AziA5)，并对其展开了同位素底物测活实验。　　 最后一部分工作是通过代谢工程改造红霉素生物合成基因簇。红霉素(Erythromycin)是由红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)生物合成产生的一类广谱大环内酯类抗生素，其中抑菌活性最高的红霉素A在临床上得到了广泛的应用。目前国内发酵的粗产物中红霉素A的含量只有60～70％，活性较差的红霉素C和B是主要的副产物。本课题采用代谢工程的方法，对红霉素生产菌的染色体进行基因改造，增加羟基化酶(EryK)和甲基化酶(EryG)的表达，并调节它们的相对表达强度，实现后修饰途径的优化，以提高发酵粗产物中的红霉素A的比例，减少副产物积累。通过基因重组引入一定比例额外拷贝的eryK基因和eryG基因引起它们在菌体内相对转录强度的变化，大大提高了从红霉素D到红霉素A的转化率。经研究发现，两种含有三个拷贝eryK基因和两个拷贝eryG基因的重组菌mCYKKG-KI和mCYKGK-KI发酵液的生物效价有近25％的提高；同时其组份分析结果表明两者完全去除了杂质组份红霉素B和C，eryK基因和e，yG基因的相对转录比例在2.5～3.0：1之间。希望通过本课题的研究，实现高产优质菌种构建和过程优化两方面的突破，同时降低成本，减少环境污染，提高经济效益。　　 以上三方面的研究工作构成了本论文的主要内容。前两部分的工作主要围绕着本课题组成功克隆其生物合成基因簇的两种新型生物碱多肽骨架形成的机制研究展开，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法阐明其生物合成机理；另外一部分的工作则是直接通过代谢工程的手段改造生物合成机制已被研究的较为清楚的红霉素生物合成基因簇，以优化发酵产物中活性最好的成分红霉素A的组分及产量。