泰和乌骨鸡是我国传统滋补鸡种,其药用价值已经被前人所证实,如人们熟知的“乌鸡白凤丸”就是以乌骨鸡作为主要成分。乌骨鸡有补血、益阴的功效,作为食品安全性高,易被人们接受。目前乌骨鸡大多用于日常简单烹食,其工业化产品较单一,其营养和补益价值有待更进一步地研究和开发。矿物元素在自然界机体中的过载与缺乏均对机体有较大的影响。Fe2+是人体合成血红蛋白必不可少的矿物元素;Cu2+作为生物体中重要微量元素之一,是许多活性酶的组成成分。金属螯合肽是一类可以与金属离子发生螯合反应的多肽物质,金属螯合肽在肠道内可借助多肽吸收转运途径,起到促进矿物元素吸收的作用,还有调节免疫、抗氧化、抑菌性、降血糖、血脂等多种生物活性。本文综合应用现代食品分离技术、现代仪器分析等方法,以Fe2+螯合活性为导向对乌骨鸡多肽FBP35进行分离、纯化研究,优化分离条件,并对各分离组分的基本理化性质及其体外金属螯合、抗氧化活性进行研究,为乌骨鸡深度开发提供理论基础和科学依据,有助于促进乌骨鸡产业的发展,提高乌骨鸡产品附加值。本文主要研究结果概括如下:1.通过树脂静态吸附实验,考察了 5种型号树脂对乌骨鸡多肽FBP35吸附能力、解吸率及未吸附组分Fe2+螯合能力,优选出003号树脂为最佳分离介质、其对FBP35单位吸附能力达到55.88 mg/g,单位解吸能力达到54.22 mg/g,003号树脂未吸附组分Fe2+半数螯合浓度(IC50)为4.89 mg/mL,其综合吸附性能明显强于其他4种树脂,则确定003号树脂为FBP35动态洗脱树脂;2.研究003号树脂对乌骨鸡多肽FBP35的动态洗脱:分别以1号溶剂、25%、50%、75%含量的2号溶剂洗脱液对FBP35进行依次洗脱,确定1号溶剂洗脱组分FBP358收率达到67.3%;FBP358Fe2+半数螯合浓度(IC50)为4.00 mg/mL,较原液FBP35的Fe2+螯合活性提高了 1.8倍;3.通过2号溶剂对FBP358进行分级纯化,并获得7个分离组分,各组分收率依次为 FBP3584(2.03%)、FBP3585(19.08%)、FBP3586(24.51%)、FBP3587(19.62%)、FBP3588(7.94%)、FBP3589(5.97%)、FBPsQ(20.86%),且各组分 Fe2+半数螯合浓度:FBP358(IC50=4.00 mg/mL)、FBP3584(IC50=0.59 mg/mL),FBP3585(IC50=3.22 mg/mL),FBP3586(IC50=3.72 mg/mL),FBP3587(IC50=4.32mg/mL),FBP3588(IC50=5.23 mg/mL),FBP3589(IC50=7.21 mg/mL),FBPsQ(IC50=6.56 mg/mL),FBP3584组分的Fe2+螯合活性最佳,较FBP358的Fe2+螯合活性提高了 6.78倍;FBP3 5 84、FBP3585、FBP3586、FBP3587四个组分的总含量占比为65.25%,四个组分对FBP358的Fe2+螯合活性贡献率为82%,采用70%含量2号溶剂沉淀FBP358可以得到82%的Fe2+活性效能和65%多肽物质,分离产物的Fe2+螯合活性提高了1.4 倍;4.利用福林酚法测定FBP35、FBP358、FBP642蛋白质含量,结果表明:蛋白含量依次为 FBP35(812.62 mg/g)、FBP358(946.91 mg/g)、FBP642(702.06mg/g),FBP35经003号树脂分离后,FBP358蛋白纯度较FBP35提高了 1.17倍,FBP642蛋白纯度较FBP35降低了 13.62%,表明003号树脂可以吸附FBP35中的非蛋白成分,从而提高FBP358的金属螯合肽纯度;5.通过对 FBP3584、FBP358、FBP642 氨基酸组成分析,发现:FBP3584、FBP358和FBP642均含有16种氨基酸,三种肽的必需氨基酸和鲜味氨基酸差异不显著;FBP642的芳香族氨基酸含量比较高;FBP358、FBP642、FBP3584疏水氨基酸含量占比分别为32.61%、40.05%、36.05%;亲水性氨基酸分别为59.56%、56.37%、60.07%;Fe2+螯合能力最强组分FBP3584中与Fe2+螯合能力呈正相关的谷氨酸、天冬氨酸百分比含量分别为18.26%、13.69%,显著高于FBP358和FBP642;6.通过高效液相凝胶色谱法考察乌骨鸡多肽FBP358及其各分离组分的分子量大小和分子量分布,结果表明:各分离组分中分子量1000 Da以下的低聚肽超过90%以上,均属于易被人体吸收的小分子肽;随着溶剂浓度的增加,分级沉淀组分中小分子肽含量显著增加,表明分级沉淀法可将FBP358根据分子量大小进行分离;7.建立了邻苯二酚紫法测定各分离组分的Cu2+螯合能力,确定反应体系pH=6;紫外检测波长为614 nm,螯合时间30 min,螯合温度为37℃为最佳测定条件。在0.25～4 mg/mL的浓度范围内,各分离组分Cu2+半数螯合浓度是BP35(IC50=0.55 mg/mL)、FBP358(IC50=0.26 mg/mL)、FBP642(IC50=1.01 mg/mL)、FBP3584(IC50=0.33 mg/mL)、FBP3585(IC50=0.37 mg/mL)、FBP3586(IC50=0.51 mg/mL)、FBP3587(IC50=0.33 mg/mL)、FBP3588(IC50=0.30 mg/mL)、FBP3589(IC50=0.3 mg/mL)、FBPsQ(IC50=0.54 mg/mL);8.通过DPPH自由基清除实验条件的优化,考察乌骨鸡金属螯合肽的各分离组分的DPPH自由基清除活性。确定40%乙醇溶液作为DPPH和乌骨鸡多肽样品的溶剂;各分离组分DPPH自由基清除能力差异显著,半数清除浓度分别为:FBP35(IC50=3.45 mg/mL)、FBP358(IC50=3.04 mg/mL)、FBP642(IC50=5.30 mg/mL)、FBP3584(IC50=8.16 mg/mL)、FBP3585(IC50=9.88 mg/mL)、FBP3586(IC50=6.17 mg/mL)、FBP3587(IC50=3.16 mg/mL)、FBP3588(IC50=3.40mg/mL)、FBP3589(IC50=3.23 mg/mL)、FBPsQ(IC50=2.78 mg/mL);其中 1 号溶剂洗脱组分FBP358清除活性较FBP35提高了 1.2倍,FBP642的清除活性较FBP35降低了 1.53倍;FBP3584、FBP3585 和 FBP3586 组分 DPPH 清除活性较弱,FBP3587、FBP3588、FBP3589和FBPsQ的DPPH清除能力几乎与原液相当,可以看出FBP358的DPPH清除活性主要分布在小分子肽含量高区域。FBP3587、FBP3588、FBP3589和FBPsQ含量之和占比为54.39%,占各组分活性贡献值总和的74.77%;9.通过·OH清除实验条件优化,考察乌骨鸡金属螯合肽的各分离组分·OH清除活性。结果表明:Fe2+浓度是影响·OH生成的最重要因素,确定反应体系Fe2+终浓度为0.6 mmol/L,H2O2终浓度为0.48 mmol/L,水杨酸终浓度为1.2 mmol/L;各分离组分具有一定的·OH清除能力,且差异显著。各分离组分·OH半数清除浓度分别为:FBP35(IC50=3.53 mg/mL)、FBP358(IC50=4.36 mg/mL)、FBP642(IC50=4.66 mg/mL)、FBP3584(IC50=1.01 mg/mL)、FBP3585(IC50=1.12 mg/mL)、FBP3586(IC50=3.39 mg/mL)、FBP3587(IC50=4.87 mg/mL)、FBP3588(IC50=3.81 mg/mL)、FBP3589(IC50=5.23 mg/mL)、FBPsQ(IC50=3.86mg/mL)。FBP358 的·OH清除能力明显强于FBP642,较原液FBP35提高了 1.24倍,其中FBP3584和FBP3585组分的·OH清除活性显著优于其他5个分离组分,较原液分别提高了 4.32倍和3.89倍,乌骨鸡金属螯合肽的·OH清除活性主要分布在大分子量多肽含量高部位,与各组分的Fe2+螯合性质趋势相似;FBP3584、FBP3585、FBP3586含量之和为45.63%,占各组分活性贡献值总和的78.55%;10.通过O2-·清除实验条件优化,考察乌骨鸡金属螯合肽各分离组分的O2-·清除活性,结果表明:反应体系pH=8.2,邻苯三酚浓度为0.2mmol/L,反应温度为25℃为最佳实验条件;各分离组分02-·清除能力差异显著。其中各分离组分O2-·半数清除浓度为:FBP35(IC50=2.91 mg/mL)、FBP358(IC50=3.29 mg/mL)、FBP642(IC50=5.92 mg/mL)、FBP3584(IC50=2.25 mg/mL)、FBP3585(IC50=2.71 mg/mL)、FBP3586(IC50=4.04 mg/mL)、FBP3587(IC50=2.25 mg/mL)、FBP3588(IC50=0.86 mg/mL)、FBP358.9(IC50=0.86 mg/mL)、FBPsQ(IC50=1.24 mg/mL),FBP358的02·清除能力明显强于 FBP642。FBP3588、FBP3589、FBPsQ的O2-·清除活性较原液分别提高了 3.38倍、3.06倍和2.35倍。FBP358的O2-·清除活性主要分布在小分子肽含量高的部位,与各分离组分对DPPH自由基清除性质有趋同性。FBP3587、FBP3588、FBP3589 和 FBPsQ含量总和为 54.39%,且02-·清除活性贡献率和为117%;11.通过Spss软件Pearson相关分析考察分离组分各生物活性间的关联性,结果表明:FBP358各分离组分Fe2+、Cu2+螯合活性呈显著正相关,相关系数为0.649,可知乌骨鸡金属螯合肽对Fe2+、Cu2+螯合性质具有趋同性;Fe2+螯合活性与·OH清除活性呈极显著正相关,相关系数为0.845,所获组分中Fe2+螯合活性较高组分,·OH清除活性较高;DPPH清除活性与O2-·清除活性呈显著正相关,DPPH清除活性与·OH清除活性呈显著负相关,相关系数为负0.754,FBP358的DPPH清除活性与O2-·清除活性主要分布在小分子肽部位中,而·OH清除活性主要分布在分子量较高的组分中。