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目的:恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)是一种源于胸膜间皮细胞、以局部侵袭为主、恶性度较高的罕见疾病。大多数恶性间皮瘤由石棉类物质的过多接触引起。尽管现在有很多治疗手段,但仍然是一个棘手的病症。它的潜伏期很长,目前也没有可行的预防手段。未来数十年中,在很多工业化国家及新兴发展中国家中病人的数量会持续攀升。胸膜切除术是一个仅适用于早期患者的治疗选择,但根治术后仍经常复发。间皮瘤对放射治疗拮抗,因此仅在姑息疗法时使用。因此对大多数患者来说化学疗法是首选,联合使用顺铂(CDDP)和培美曲塞(PEM)是目前一线的治疗方案。然而,联合顺铂和培美曲塞的治疗方案平均生存期仅为12.1个月,且预后差。因此需要有一个新的治疗方案来提高病人的预后和生活质量。大多数恶性间皮瘤含有野生型P53基因,但p14ARF、p16INK4A基因缺陷。本实验通过强制表达p53(Ad-p53):以腺病毒为载体,p53为治疗基因,检测是否会抑制间皮瘤细胞的生长,以及Ad-p53与顺铂或培美曲塞联用是否产生抗肿瘤效果。结果显示Ad-p53进行间皮瘤转导,诱导P53磷酸化,从而上调p21和下调phos-Rb表达水平,并引起细胞凋亡蛋白酶8(caspase-8)和3(caspase-3)的剪切,从而引起癌细胞凋亡;细胞周期分析显示出增加的G0/G1期比例以及sub-G1期比例,主要取决于细胞类型和Ad-p53的剂量;体外实验Ad-p53转导抑制了间皮瘤细胞活性并以协同的方式,增强了顺铂或培美曲塞的抑制效应;胸腔内注射Ad-p53和顺铂全身给药在原位动物模型产生出抗肿瘤效果。这些数据共同表明腺病毒携带P53基因(Ad-p53)是一种可以与一线药物联合治疗间皮瘤的方法。方法:本研究选用人体间皮瘤细胞系,NCI-H2452, NCI-H2052, NCI-H226, NCI-H28及MSTO-211H。通过MTT实验,检测Ad-p53的转导对此5种间皮瘤细胞系的增殖抑制效果。使用流式细胞周期分析方法检测Ad-p53对细胞周期变化的影响。以Western blot方法研究Ad-p53转导引起的细胞凋亡传导通路。MTT实验,检测Ad-p53和CDDP或PEM联合用药产生协同的癌细胞抑制作用。最后又运用动物体内实验,检测Ad-p53和CDDP的联合抗肿瘤效果。结果:1 MTT分析结果Ad-p53基因治疗,除了NCI-H2052细胞外,以剂量依赖方式抑制了NCI-H28、NCI-H2452、NCI-H226和MSTO-211H间皮瘤细胞的生长,而对照组Ad-LacZ则未抑制间皮瘤细胞的生长。50%抑制浓度值(IC50)显示NCI-H28细胞对Ad-p53最敏感,随后是NCI-H2452细胞,而NCI-H226和MSTO-211H细胞敏感程度相似。NCI-H2052细胞对Ad-p53不敏感,部分原因可能是Ad受体的低表达水平。2流式细胞周期分析结果Ad-p53感染间皮瘤细胞系MSTO-211H和NCI-H28。Ad-p53诱导了MSTO-211H细胞G0/G1期的静止和sub-G1的增加;而Ad-p53感染NCI-H28细胞后显现出G2/M期比例增加,S期比例下降,及明显的sub-G1的增加。与MSTO-211H细胞相比,NCI-H28细胞的sub-G1增加的更为显著,显示出NCI-H28细胞对Ad-p53介导的细胞凋亡具有更高的敏感性。3蛋白质印迹分析结果3.1蛋白质印迹分析法检测了在MESO-211H和NCI-H28细胞中Ad-p53介导的分子传导通路。Ad-p53诱导P53磷酸化及P21表达水平的增加。Phos-Rb的下调,相当于从磷酸化状态到非磷酸化状态的转换。以上数据共同表明Ad-p53激活了p53介导的分子传导通路;3.2在MSTO-211H和NIC-H28两个细胞系中,Ad-p53转导后诱发了caspase-3和caspase-8的剪切,却没有诱导caspase-9的剪切。Bid表达水平保持不变,t-Bid在两种细胞中均未检测到。这些数据共同表明Ad-p53转导通过caspase-8激活了的死亡受体介导的外源性凋亡通路,但通过caspase-9线粒体介导的内源性凋亡通路却很可能未被涉及。4 MTT分析Ad-p53与抗肿瘤药物的联合协同作用4.1 MSTO-211H和NIC-H28细胞用不同浓度的CDDP作用后,再进行Ad-p53转导。结果显示Ad-p53诱导增强了CDDP产生的抗肿瘤效果,CalcuSyn软件分析显示Ad-p53和CDDP联合应用产生协同的癌细胞抑制作用。4.2 MSTO-211H和NIC-H28细胞用不同浓度的PEM作用后,再进行Ad-p53转导。结果显示Ad-p53诱导增强了PEM产生的抗肿瘤效果,CalcuSyn软件分析显示Ad-p53和PEM联合应用产生协同的癌细胞抑制作用。5体内抗肿瘤试验结果间皮瘤细胞系(MSTO-211H)通过胸腔注射到免疫缺陷老鼠的胸腔内,从而扩大其胸膜内扩散转移。给裸鼠胸腔内注射Ad-p53 , Ad-LacZ作为对照。28天的肿瘤重量显示Ad-p53产生出抗肿瘤效果,而对照组Ad-LacZ治疗却没能影响肿瘤重量。Ad-p53和CDDP给药中,两者均能单独抑制肿瘤生长,但两者联用产生的抑制肿瘤能力大大优于单用Ad-p53或单用CDDP。结论:1 Ad-p53以剂量依赖性的方式抑制了间皮瘤细胞的生长。2 Ad-p53诱导间皮瘤细胞周期变化,从而导致细胞凋亡。3 Ad-p53激活了p53介导的分子传导通路及外源性细胞凋亡通路。4 Ad-p53增强了抗肿瘤试剂的细胞毒性。5 Ad-p53和顺铂联用产生协同的体内抗肿瘤效果。综上所述,Ad-p53转导抑制了间皮瘤细胞活性并以协同的方式增强了顺铂或培美曲塞的细胞增殖抑制效应,胸腔内注射Ad-p53和顺铂全身给药在原位动物模型产生出抗肿瘤效果。