两栖类皮肤分泌物是个巨大的生物资源宝库，具有很大的开发潜力。现已在两栖类皮肤分泌物中发现的活性物质数量庞大。两栖类裸露、湿润的皮肤，分泌的活性物质能够有效抵御外来有害生物的侵袭，成为其维护生命的第一道防线。生物活性肽是两栖类皮肤分泌物中的主要成分，同时也是两栖类先天免疫系统的重要组成部分。本研究是以采自于中国云南昭通的棕点湍蛙（Amolops loloensis）为试验材料，采用生物化学和分子生物学方法对其皮肤分泌物中抗菌肽分子多样性及其结构和活性进行研究，并结合数据分析软件对结果进行分析。　　 本论文主要通过Sephadex G-50凝胶过滤层析和反相高压液相层析（RP-HPLC）对棕点湍蛙的皮肤分泌物进行分离纯化，结果得到5种新的抗菌肽，结合同源性比对结果以及抗菌肽结构特点进行命名；其中两种属于esculentin-2家族，分别命名为esculentin-2-ALa and-ALb，该家族的抗菌肽在湍蛙属（Amolops）中还是首次报道；另外三种属于temporin家族，分别命名为temporin-ALd、temporin-ALe、temporin-Alf。然后，通过Edman降解法测定它们的全长序列，esculentin-2-ALa和ALb全长序列分别为：GIFALIKTAAKFVGKNLLKQAGKAGLEHLACKANNQ和GIFSLIKTAAKFVGKNLLKQAGKAGVEHLACKANNQC；temporin-ALd至Alf为：FLPIAGKL-LSGLSGLL-NH2、FFPIVGKLLFGLSGLL-NH2和FFPIVGKLLSGLSGLL-NH2；然后，运用基质辅助激光解离离子化技术（MALDI-TOF-MS）测定它们的分子量分别为3866.42 Da、3868.57 Da、1596.72 Da、1719.25 Da、1659.29 Da。为了进一步研究棕点湍蛙皮肤分泌液中抗菌肽分子多样性，使用CLONTECH公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了棕点湍蛙皮肤的cDNA文库，根据蛋白序列比对，以源自棕点湍蛙抗菌肽的信号肽N端序列设计特异引物序（5-ATGTTC（A/C）-CC（A/T）TGGAAG-AATCC-3’），反向引物由cDNA合成试剂盒提供的primerⅡ A；本研究从棕点湍蛙皮肤抗菌肽克隆文库中，除了之前所发现的抗菌肽之外，还筛选得到新型的10条编码esculentin-2-AL和temporin-AL前体cDNA核酸序列（GenBank accession no.：EU311547-EU311556）。　　 人工合成10种源自棕点湍蛙皮肤分泌液中不同的抗菌肽，分属于两个抗菌肽家族，对它们进行生物学活性研究。抗菌活性结果表明：其中大多数抗菌肽对测试菌中的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌都具有较强的抑菌活性。只有temporin-ALk对短小芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌没有抗菌活性。Esculentin-2-ALs和temporin-ALs对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的具有很强的抗菌活性。溶血活性检测结果：这十种抗菌肽多数都具有溶血活性，抗菌肽浓度100μg·mL-1时，temporin-ALk溶血活性最强，可以诱导最多25％的兔红细胞溶解；而temporin-Alf的溶血活性最弱，只有7％兔红细胞溶解。对从棕点湍蛙皮肤分泌液中克隆得到的抗菌肽序列，用Mega及DAMBE分子生物学软件进行遗传学分析，结果表明，编码棕点湍蛙皮肤抗菌肽前体的cDNA序列之间的碱基转换和颠换之比都小于1，说明大部分这些序列之间碱基颠换的数量大于转换，引起这些序列突变的原因主要来源于碱基颠换；并对其进行同义突变率及错义突变率检测发现，棕点湍蛙皮肤抗菌肽前体的cDNA序列中各部分的变异度有明显的差异，它们很可能经受着不同的选择压力。