目的:大鼠骨髓间充质干细胞( Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)体外分离、培养、扩增;β-巯基乙醇体外诱导其向神经组织分化,电镜及免疫细胞化学染色法鉴定分化细胞方向;Longa改良线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion ,MCAO)模型,观察第4代骨髓间充质干细胞静脉移植对成模大鼠的治疗效果;明确骨髓间充质干细胞是否可经血液循环归巢至受损脑区;是否可在脑内存活、迁移、并向神经组织分化;是否促进神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)、脑源性神经生长因子(Brain-drived neurotrophic factor,BDNF)、血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor ,VEGF )的分泌;是否减少脑缺血半暗带区细胞凋亡。以此探讨BMSCs的生物学特性及静脉移植治疗大鼠脑梗死的效果和机制。方法:1取3~4周龄的健康雄性SD大鼠,采用percoll密度梯度离心法结合贴壁法分离培养BMSCs,传代扩增,取第4代细胞进行诱导分化,倒置相差显微镜下进行形态学观察。2按照Woodbury方案进行预诱导和诱导。L-DMEM培养基+1mmol/Lβ-巯基乙醇+20%FBS预诱导24小时后,L-DMEM+5mmol/Lβ-巯基乙醇诱导5小时,之后去除诱导液为常规培养基,再培养2周。3诱导后进行细胞鉴定:倒置相差显微镜下观测细胞形态学变化;透射电镜观察细胞超微结构的改变;免疫细胞化学染色法对诱导细胞进行神经前体细胞表面标志(神经上皮巢蛋白nestin)、神经元细胞表面标志(神经元特异性烯醇化酶neuron specific enolase, NSE)、神经胶质细胞表面标志(胶质纤维酸性蛋白glial fibrillary acidic protein, GFAP)的鉴定。4第3代BMSCs传代、换液后进行Brdu标记,时间大约3天,待第4代细胞长满瓶底时收集细胞,待移植。5健康雄性成年SD大鼠(3月龄,体重270-300g),Longa改良线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion ,MCAO)模型。取成模大鼠50只随机分成两组,BMSCs移植组和PBS对照组,每组25只。6于MCAO 24h后,将Brdu标记的第4代BMSCs细胞1mL(含3x106个细胞)从尾静脉植入BMSCs组大鼠,对照组同样途径给予等量PBS。于MCAO后1天(移植前)、移植后7、14、21天各组大鼠分别进行改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Scores ,mNSS);移植术后7天,各组大鼠分别随机取5只进行TTC染色测定梗死体积;再于同一天和第14、21、28天两组各处死大鼠5只,灌注取脑,多聚甲醛固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制作石蜡切片。分别行HE染色观察脑缺血病理改变;TUNEL染色观察细胞凋亡;免疫组织化学染色鉴定移植入脑的BMSCs及分化以及NGF、BDNF、VEGF等因子的分泌。7统计学处理实验数据建立EXCEL数据库,资料采用SPSS11.5统计分析软件进行数据处理。两组间同一时间点样本均数采用两独立样本t检验,同一组内不同时间点组间均数之间采用单因素方差分析。所有数据以均数±标准差(±S)表示,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1 BMSCs接种初期细胞呈圆形悬浮状态,24小时后大部分细胞贴壁。贴壁细胞单个分散存在或形成数个细胞克隆,逐渐伸角变形,呈圆形、多角形、长梭形等多种形态。传代后,细胞形态逐渐纯化,至第4代,形态单一,呈长梭形,漩涡状和平行排列生长。2预诱导后细胞形态无明显变化,加入诱导液后细胞形态迅速改变,诱导5小时部分细胞漂浮、崩解、死亡,细胞形态不再发生明显改变,大部分细胞呈现神经元样形态。之后用常规培养基替换诱导液,一周以后,大多数细胞仍为神经元样形态,第2周细胞形态缓慢改变,2周时,细胞形态逐渐回到诱导前扁平的梭形状态。3诱导后细胞神经标志物的免疫细胞化学检测显示:空白对照组Nestin、NSE、GFAP均无表达。其余组, GFAP均为阴性。预诱导组Nestin阳性细胞表达,Nestin阳性细胞数在诱导1h后达到高峰,约为29.35%,诱导5h时几乎测不到。NSE阳性细胞率随诱导时间延长逐渐提高,诱导5h时NSE的阳性率约为57.53%。Nestin、NSE两个指标预诱导24h,诱导1h,诱导5h三个时间点阳性细胞率比较均有统计学意义(P<0.01)。撤出诱导液常规培养细胞形态恢复到诱导前时,此时检测Nestin、NSE、GFAP均为阴性。4透射电镜结果:未诱导的BMSCs,胞核呈不规则形,胞浆较少,核质比大,细胞器不发达,偶尔可见处于分裂过程的细胞,表现出早期幼稚细胞特点。与诱导前相比,诱导后细胞胞核大而圆,核仁明显,细胞质内细胞器更多,细胞核旁有丰富的高尔基复合体,可见大量扩张成圆形的粗面内质网和部分扁平(静止状态)的粗面内质网,可见圆形、椭圆形线粒体,少量游离核糖体。5大鼠右侧MCAO后,出现行走向右侧转圈或向右侧跌倒。术后1天TTC染色:梗死灶成白色,位于右侧额顶颞区皮层、基底节区;术后1天HE染色:右侧额颞顶叶皮层和基底节区大量神经细胞消失,可见固缩、碎裂、变形的胞核,浓染的胞浆,间质水肿明显。以上均提示形成大脑中动脉供血范围梗死。6两组大鼠在术后24h神经功能缺损评分(mNSS)明显升高,两组无差异(P>0.05)。各组评分随时间呈逐步下降趋势,自移植后第7天开始的3个时间点, BMSCs组大鼠的神经缺损评分比同时间点的对照组有明显的降低,且差异显著(7d,p<0.05;14d、21d, p<0.01)。7移植后7d,TTC染色提示BMSCs移植组与对照组相比梗死体积缩小,且差异显著(梗死体积:BMSCs组为21.21%土1.58%,对照组为25.75%土2.08%(P<0.05)。8 HE染色显示:两组均可见坏死中心神经元大量缺失,胶质细胞增生,微血管增生, BMSCs组和对照组比较,胶质细胞增生较少,微血管增生明显。9 TUNEL染色显示:两组在缺血边缘区均可见核染成棕色的凋亡细胞,BMSCs组凋亡细胞较对照组明显减少,BMSCs组24.6±3.2/HP;对照组64.2±4.1/HP(P=1.53403E-07< 0.01)。10 BMSCs组大鼠在移植后4个时间点均检测到Brdu标记阳性细胞, DAB染色核显棕黄色,主要位于半球缺血区及缺血边缘区,阳性细胞计数第7天43.6±2.7/HP,第14天35.8±2.59/HP,第21天18.4±2.4HP,第28天11.4±1.14/HP,随时间延长呈逐渐下降趋势(P<0.01)。第21天脑片检测到Brdu/GFAP双标阳性细胞(未计数),Brdu/NSE双标阳性结果不理想。BMSCs组缺血边缘区GFAP阳性细胞数少于对照组(未计数)。11两组第7天脑片,BDNF、NGF、VEGF免疫组化染色:阳性结果为胞浆显棕黄色。BDNF表达,BMSCs组:平均光密度值=IOD/area=0.47±0.05,对照组:平均光密度值=IOD/area=0.31±0.03;NGF表达,BMSCs组:平均光密度值=IOD/area=0.49±0.10 ,对照组:平均光密度值=IOD/area=0.28±0.11;VEGF表达,BMSCs组:平均光密度值=IOD/area=0.28±0.03 ,对照组:平均光密度值=IOD/area=0.13±0.05。BMSCs组BDNF、NGF、VEGF阳性细胞累积平均光密度值较对照组明显增高,两独立样本t检验p值分别为0.000596、0.001877、1.92151E-05,均小于0.01。结论:1 Percoll密度梯度离心及贴壁法联合应用,可获得良好纯化的BMSCs。2 BMSCs经β-巯基乙醇诱导后,形态向神经元样细胞转变,GFAP表达阴性, Nestin表达在NSE之前,说明β-巯基乙醇体外诱导BMSCs可分化为神经元样细胞,不能分化为神经胶质细胞;BMScs首先分化为神经干(前体)细胞,再转分化为神经元样细胞。同时这种化学诱导的转分化过程迅速、可逆,不能稳定持久,且损伤细胞。故分化后的BMSCs不宜用作干细胞疗法的种子细胞。3 Longa改良线栓法可得到大鼠稳定MCAO模型,该模型易于复制,梗死部位位于大脑中动脉供血区,位置较恒定,是研究缺血性卒中理想的动物模型。4脑缺血大鼠静脉移植BMSCs后,显著改善了受损的神经功能。植入的细胞大多归巢至缺血灶及其边缘,少数细胞存活(至少1月)、分化并可能部分替代受损细胞;通过增加神经营养因子NGF、BDNF的表达,从而影响缺血区微环境,减少缺血半暗带区细胞凋亡起到神经保护作用;增加血管内皮生长因子VEGF的分泌促进血管生成;降低缺血灶边缘疤痕壁的厚度;等等多重途径使脑梗死大鼠受损神经功能得以改善。5本实验研究为体外诱导BMSCs神经分化,体内移植治疗脑梗死提供了一定的实验基础和理论依据。