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第一部分在PD转基因模型中存在生物节律的现象及钟基因表达的异常目的:临床研究和动物实验均提示帕金森疾病(Parkinson’sDisease)中存在着生物节律的紊乱,如睡眠障碍、24小时内心率和血压的波动异常以及钟基因的表达异常等。并且,在其他突触核蛋白病中如多系统萎缩和路易体痴呆中,也存在类似的生物节律异常的表现。然而,这些疾病的共同的病理表现—α-突触核蛋白(synulein,SNCA)的聚集与生物节律的异常的发生之间有无联系,尚不明确。因此本研究旨在探讨突触核蛋白的异常表达是否会引起生物节律的异常,尤其是否会影响生物钟相关蛋白BMAL1(Brain and muscle Arnt-like protein)的表达。材料与方法:采用3月龄和5月龄左右的野生型小鼠和突触核蛋白过表达的小鼠,采用生物节律检测系统检测小鼠的静息-活动周期,并采用能量代谢笼的方法分析小鼠的24小时内每个时间点的活动量;通过实时荧光定量方法(Real-time Quantitative PCR Detecting System,QPCR)检测生物钟相关基因的 mRNA 水平的变化;采用免疫印迹的方法检测BMAL1蛋白的变化。同时,在离体水平上,采用过表达α-突触核蛋白的PC12细胞模型观察BMAL1蛋白和mRNA的变化。结果:无论在3月龄还是5月龄时,与野生小鼠相比,α-突触核蛋白过表达的小鼠活动周期无明显改变,但是对于24小时活动的节律,两者之间有一定的异常。同时,QPCR提示:3月龄时,SNCAA53T鼠的视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)内的钟基因BMAL1的表达较同龄野生型小鼠有下降的趋势;而5月龄时,SNCAA53T鼠的SCN中的钟基因BMAL1的表达较同龄野生鼠相比明显降低。另外,免疫印迹的结果进一步验证了,5月龄时,SNCAA53T鼠的钟基因BMAL1的表达较同龄野生鼠相比明显降低。离体细胞实验进一步证实,无论是稳定转染还是瞬时转染SNCA都可诱导BMAL1蛋白的表达水平下降。结论:我们的研究通过离体和在体的实验,证实了 α-突触核蛋白的异常表达可能导致生物节律的异常以及生物钟相关蛋白BMAL1的表达下降。第二部分α-突触核蛋白导致BMAL1蛋白表达减少的机制目的:前期的实验数据证明SNCA的过度表达会导致生物节律的异常,同时也会引起BMAL1蛋白和mRNA的水平有一定的下降。另外,也有文献报道在帕金森病的患者中也可见BMA4L1mRNA的改变,然而其中的机制并不清楚。因此本部分的研究旨在探讨α-突触核蛋白的异常表达是如何调控生物钟相关蛋白BMAL1的表达。材料与方法:采用慢病毒感染的方法获得稳定转染的SNCA和空载(Vector)的PC12细胞,然后采用放线菌酮(cycloheximide,CHX)处理细胞,观察BMAL1蛋白的降解速率;通过实时荧光定量PCR检测生物钟相关基因的mRNA水平的变化。进一步采用焦磷酸盐处理的方法检测了 BM4L1启动子的甲基化程度的改变,同时用QPCR的方法检测了甲基化转移酶的表达水平。接着,再次采用放线菌素D(DactinomyxinD)处理细胞,观察BMAL1 mRNA的稳定性的改变。然后,采用QPCR的方法检测了 miR-155的表达水平,并采用miR-155的抑制性的核酸类似物进一步验证了 miR-155对BMAL1表达调节作用。结果:与Vector组相比,SNCA过表达组中BMAL1蛋白的降解速度并无明显的变化;而QPCR显示,SNCA过表达组中BMAL1mRNA表达下降。而且,与Vector组相比,SNCA过表达组中BM4L1的启动子活性及甲基化转移酶都无明显的变化;但是通过检测mRNA的稳定性发现,SNCA过表达组中BMAL1mRNA的稳定性减弱,尤其是在放线菌素处理3小时后,最为明显。另外,我们发现了在SNCA过表达会导致miR-155的水平上升,并且miR-155的抑制剂可以部分逆转BMAL1的mRNA和蛋白水平的下降。结论:我们的研究提示了 α-突触核蛋白的异常聚集可能导致生物钟相关蛋白BMAL1的表达下降,其机制可能与miR-155介导的BM4L1 mRNA的稳定性下降相关。