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背景:原发性肝癌属于上皮来源的恶性肿瘤,是全球最严重的恶性肿瘤之一,也是我国最常见的肿瘤。淋巴道转移作为其早期转移方式,是影响肝癌预后的一个重要决定因素。因此,探寻淋巴道转移相关蛋白,研究肝癌淋巴道转移的分子机制成为研究的重心。本课题组前期通过遗传背景相同、但淋巴道转移能力不同的肝癌细胞株(Hca-F细胞和Hca-P细胞),利用多种分子生物学技术发现Hca-F细胞和Hca-P细胞的ANXA7在基因和蛋白质水平上均存在显著性差异表达,并且通过在Hca-F细胞中上调表达基因ANXA7和在Hca-P细胞中下调表达基因ANXA7,研究其对细胞转移行为的影响,表明ANXA7在小鼠腹水型肝癌的淋巴道转移中发挥着重要的作用。本次实验在前期研究的基础上,通过观察钙相关蛋白STIM1、CAPN2及PYK2在高、低淋巴道转移潜能小鼠肝癌Hca-F细胞和Hca-P细胞中的表达情况及与ANXA7之间的关系,来进一步阐明肝癌淋巴道转移的分子机制。目的:通过实时定量PCR和蛋白质免疫印迹技术,确定钙相关蛋白STIM1、CAPN2及PYK2在Hca-F细胞和Hca-P细胞中的表达情况;免疫组织化学法检测钙相关蛋白STIM1、CAPN2及PYK2在小鼠腹水型肝癌组织细胞中的表达定位;利用ANXA7上调的Hca-F细胞和ANXA7下调的Hca-P细胞,观察ANXA7的表达变化与钙相关蛋白之间的关系;分析ANXA7的表达变化对钙相关蛋白表达的影响,确定与ANXA7表达密切相关的钙相关蛋白;通过细胞功能试验,检测抑制与ANXA7密切相关的钙相关蛋白的活性后,细胞迁移、侵袭及增殖能力的变化。方法:利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分别在基因水平和蛋白质水平检测钙相关蛋白STIM1、CAPN2和PYK2在Hca-F细胞,ANXA7上调的Hca-F细胞,Hca-P细胞和ANXA7下调的Hca-P细胞中的差异表达。免疫组化观察上述三种钙相关蛋白在Hca-F和Hca-P实体瘤组织细胞中的表达定位,应用CCK8法测不同浓度梯度的钙蛋白抑制剂对Hca-P细胞作用12h、24h、36h、48h后,细胞的光密度值的变化,检测ANXA7表达相关钙相关蛋白抑制剂对肿瘤细胞增殖活性的影响。Transwell实验观察肿瘤细胞穿透小室膜的细胞数,验证抑制钙相关蛋白的活性对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹结果表明,钙相关蛋白STIM1、CAPN2和PYK2在Hca-F细胞中的表达量均高于Hca-P细胞。在m RNA水平上检测各基因在Hca-F细胞和Hca-P细胞中的表达量,STIM1在Hca-F细胞中的表达量是Hca-P细胞的1.45倍,CAPN2在Hca-F细胞中的表达量是Hca-P细胞的1.67倍,PYK2在Hca-F细胞中的表达量是Hca-P细胞的1.98倍。Western Blot结果显示,STIM1在Hca-F细胞中表达量是Hca-P细胞的1.38倍,CAPN2在Hca-F细胞中表达量是Hca-P细胞3.2倍,PYK2在Hca-F细胞中表达量是Hca-P细胞的2.5倍。免疫组化结果显示钙相关蛋白STIM1、CAPN2和PYK2在Hca-F细胞实体瘤中的表达量均高于Hca-P细胞实体瘤,结果均具有统计学差异。STIM1在ANXA7上调、下调的Hca-F和Hca-P细胞中表达变化没有差异;PYK2在ANXA7上调的Hca-F细胞细胞中表达量减少,在ANXA7下调的Hca-P细胞中表达量增加;但钙蛋白酶CAPN2随着ANXA7的上下调而表现出与其变化一致的结果,说明CAPN2与ANXA7表达变化正相关。CCK8实验测得CAPN2钙蛋白酶抑制剂ALLN影响了Hca-P细胞在12h、24h、36h、48h的光密度值,提示ALLN减弱了肿瘤细胞的增殖能力。Transwell实验检测到,用ALLN培养的Hca-P细胞组穿过小室的细胞数与不加ALLN的Hca-P细胞组相比,细胞数量明显减少,结果表明ALLN抑制了肿瘤细胞的转移、侵袭能力。结论:钙相关蛋白STIM1、CAPN2和PYK2在小鼠腹水型肝癌Hca-F细胞中的表达量高于Hca-P细胞,与ANXA7在Hca-F细胞和Hca-P细胞中的差异表达结果一致。高淋巴道转移细胞中钙相关蛋白STIM1、CAPN2和PYK2的相对高表达提示钙相关蛋白STIM1、CAPN2和PYK2可能促进肿瘤细胞的淋巴道转移。CAPN2在肝细胞癌中的表达与ANXA7密切相关,随ANXA7上调而表达增加,下调而表达减少,说明CAPN2可能位于ANXA7功能通路的下游,或者ANXA7通过其机制调控CAPN2的表达。CCK8实验及Transwell实验结果表明,肝癌细胞在CAPN2钙蛋白酶抑制剂的作用下,其增殖能力,迁移和侵袭能力明显下降,与ANXA7下调的肝癌细胞的功能实验结果一致,说明CAPN2可能作为一个与ANXA7密切相关的钙相关蛋白共同参与了肝癌细胞的转移过程。