目的:本实验应用TGF-β₁基因过表达慢病毒载体转染A549/DDP细胞,诱导A549/DDP细胞发生上皮间质转化后种植于裸鼠体内,以肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞为研究对象,明确肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞上皮间质转化与耐药相关蛋白的相关性,并应用补中益气汤加以干预,观察补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞移植瘤的影响,应用分子生物学技术检测补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp和上皮间质转化分子标志物E-cad、α-CA、Vim、N-cad的干预效果及对PI3K/AKT信号通路的调节作用,以深入探讨补中益气汤通过干预上皮间质转化改善非小细胞肺癌顺铂耐药的作用机理,为临床应用培土生金法改善非小细胞肺癌耐药的理论治则提供实验依据。方法:1.肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白的相关性研究将构建成功的TGF-β₁空载慢病毒和TGF-β₁过表达慢病毒分别转染A549/DDP细胞,感染成功的细胞进行接种。取BALB/C裸鼠18只,随机分为空白组、空载组、过表达,空白组接种A549/DDP细胞,空载组接种TGF-β₁空载A549/DDP细胞,过表达组接种TGF-β₁过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg^-1,2次/周。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。显微镜观察肿瘤组织形态,免疫组化、Western blot、Real-time PCR检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT分子标志物E-cad、N-cad及肿瘤耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp蛋白和m RNA表达情况,免疫荧光双染检测E-cad、N-cad与LRP、MRP、P-gp的共定位情况,并进行相关性分析。2.补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究取BALB/C裸鼠36只,随机分为空载组（NG组）,模型组（MG组）,顺铂组（DDP组）,补中益气汤低（BD组）、中（BZ组）、高（BG组）剂量组。空载组接种TGF-β₁空载A549/DDP细胞,其余组接种TGF-β₁过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,进行药物干预。空载组和模型组腹腔注射生理盐水,0.0035 g·kg^-1,2次/周,灌胃生理盐水,1m L/次,2次/d;顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg^-1,2次/周,灌胃生理盐水,1m L/次,2次/d;补中益气汤组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg^-1,2次/周,分别灌胃低(1.46g·kg^-1生药)、中(2.92 g·kg^-1生药)、高(5.84 g·kg^-1生药)剂量补中益气汤,1 m L/次,2次/d。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。称量裸鼠瘤重,计算抑瘤率;镜下观察肿瘤组织形态学改变;免疫组化、Western blot、Real-time PCR检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp及EMT分子标志物E-cad、α-CA、Vim、N-cad蛋白和m RNA表达情况,免疫荧光双染检测补中益气汤对E-cad、N-cad及LRP、MRP、P-gp共定位的影响,明确补中益气汤是否通过干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT而改善顺铂耐药,并筛选出裸鼠体内最佳药物浓度。3.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响取BALB/C裸鼠36只,随机分为空载组（NG组）,模型组（MG组）,顺铂组（DDP组）,最佳药物浓度+顺铂组（BCD组）,顺铂+LY294002组（DLY组）,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组（BCDLY组）。空载组接种TGF-β₁空载A549/DDP细胞,其余组接种TGF-β₁过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,进行药物干预。空载组和模型组腹腔注射生理盐水,0.0035 g·kg^-1,2次/周,灌胃生理盐水,1mL/次,2次/d;顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg^-1,2次/周,灌胃生理盐水,1 mL/次,2次/d;最佳药物浓度+顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg^-1,2次/周,灌胃最佳浓度补中益气汤,1m L/次,2次/d;顺铂+LY294002组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg^-1,2次/周,腹腔注射LY294002,0.025 g·kg^-1,2次/周,灌胃生理盐水,1 m L/次,2次/d;最佳药物浓度+顺铂+LY294002组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg^-1,2次/周,腹腔注射LY294002,0.025 g·kg^-1,2次/周,灌胃最佳浓度补中益气汤,1m L/次,2次/d。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。免疫组化、Western blot检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K、AKT蛋白表达情况,免疫组化、Real-time PCR检测E-cad、N-cad蛋白和m RNA表达情况。结果:1.TGF-β₁诱导的肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白正相关HE染色结果显示,空白组、空载组细胞形态多见圆形或椭圆形,细胞核圆而均匀,细胞连接紧密,细胞间距较小;过表达组细胞可见纺锤形或长梭形改变,细胞核圆形或椭圆形,大小不一,细胞连接稀疏松散,细胞间距显著增宽。免疫组化结果显示,与空白组、空载组比较,过表达组上皮分子E-cad阳性产物表达较少,间质标记蛋白N-cad阳性产物表达较多,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达均显著增多。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空白组、空载组比较,过表达组上皮分子Ecad在蛋白和基因水平上表达显著下调,间质标记蛋白N-cad和耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp在蛋白和基因表达均显著上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光双染结果显示:与空白组、空载组比较,过表达组E-cad荧光表达明显减弱,而耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强,各组共定位区均较少,E-cad与LRP、MRP、P-gp呈负相关（P<0.05）;与空白组、空载组比较,过表达组N-cad荧光表达明显增强,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强,过表达组共定位区明显增多,N-cad与LRP、MRP、P-gp呈正相关（P<0.05）。2.补中益气汤对裸鼠瘤重的影响与空载组比较,模型组瘤重明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,顺铂组瘤重略微下降,但差异不具有统计学意义（P>0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤各干预组瘤重均有不同程度下降,差异有统计学意义（P<0.05）,高剂量组下降最明显。随着补中益气汤浓度的增加,瘤重逐渐减小,抑瘤率逐渐上升。3.补中益气汤对肿瘤组织形态学的影响空载组细胞形态多见圆形或椭圆形,细胞核圆而均匀,细胞连接紧密,细胞间距较小。模型组细胞可见纺锤形或长梭形改变,细胞核圆形或椭圆形,大小不一,细胞连接稀疏松散,细胞间距显著增宽。补中益气汤干预组肿瘤细胞形态渐变为圆形或椭圆形,细胞间隙逐渐减小,细胞排列逐渐恢复紧密,高剂量组效果最明显。4.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白的影响免疫组化结果显示,LRP、MRP、P-gp蛋白的阳性着色为深染的棕黄色颗粒,在各组均有表达。与空载组比较,模型组LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达明显增多。补中益气汤干预后,各组LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达均有不同程度下调,且补中益气汤浓度越高,效果越显著,具有一定的剂量依赖性。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组LRP、MRP、P-gp在蛋白和基因水平上表达均明显上调（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤各干预组LRP、MRP、P-gp蛋白和m RNA表达均有不同程度下降,中、高剂量组具有统计学意义（P<0.05）。5.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT的影响免疫组化结果显示,E-cad、α-CA、Vim、N-cad蛋白阳性着色为深染的棕黄色颗粒,各组均有表达。与空载组比较,模型组上皮分子E-cad、α-CA蛋白表达明显减少,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白表达明显增多;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤干预组上皮分子E-cad、α-CA蛋白表达逐渐增多,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白表达逐渐减少。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组上皮分子E-cad、α-CA蛋白和m RNA表达显著减少,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白和m RNA表达显著增多（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤中、高剂量组上皮分子E-cad、α-CA蛋白和m RNA表达增多,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白和m RNA表达减少（P<0.05）,高剂量组效果最为显著。免疫荧光双染结果显示,与空载组比较,模型组E-cad荧光表达明显减弱,N-cad荧光表达明显增强,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强。补中益气汤干预后,E-cad荧光表达逐渐增强,N-cad荧光表达逐渐减弱,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达逐渐减弱,E-cad与LRP、MRP、P-gp呈负相关（P<0.05）,N-cad与LRP、MRP、P-gp呈正相关（P<0.05）。6.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响免疫组化和Western blot结果显示,与空载组比较,模型组p-PI3K、p-AKT蛋白阳性表达明显增多（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂组、顺铂+LY294002组、最佳药物浓度+顺铂+LY294002组p-PI3K、p-AKT蛋白阳性表达逐渐减少（P<0.05）;与顺铂+LY294002组比较,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组p-PI3K、p-AKT蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达明显减少,间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达明显增多;与模型组、顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂组、顺铂+LY294002组、最佳药物浓度+顺铂+LY294002组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达逐渐增多,间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达逐渐减少;与最佳药物浓度+顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达增多,而间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达减少。结论:1.肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白表达呈正相关,EMT程度越高,肿瘤耐药相关蛋白表达越高,提示肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT是顺铂耐药的重要机制之一。2.补中益气汤有限制肺腺癌移植瘤生长,改善肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞顺铂耐药,抑制肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT的作用;该作用有一定的量效关系,高浓度(5.84 g·kg^-1生药)为裸鼠体内最佳用药浓度。3.补中益气汤能够改善肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞顺铂耐药,其机制可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,上调上皮分子表达,下调间质标记蛋白表达,抑制肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT,从而抑制EMT介导的耐药过程实现的。