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第一部分 EAE模型小鼠脑组织和体外用IL-17刺激星形胶质细胞诱导下调的microRNA及其上调的Hif1α的表达分析目的:探讨EAE模型小鼠的脑组织和体外用IL-17刺激星形胶质细胞后,其microRNA(miRNA)和转录因子,即缺氧诱导因子 1α(hypoxia inducible factor 1α,Hif1α)的表达变化。方法:用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)注射复制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型并予鉴定,同时在体外培养和鉴定C57BL/6小鼠的原代星形胶质细胞;通过miRNA芯片筛查分析EAE模型小鼠发病14d、20d时脑组织中(体内)及用IL-17刺激小鼠原代星形胶质细胞(体外)后3h、6h,下调miRNA表达谱的变化,并找出体内外共表达下调的miRNA;另在EAE小鼠建模后7d、14d、18d和20d和在IL-17刺激小鼠星形胶质细胞后3h、6h、12h、24h和48h,行Western blot方法检查EAE小鼠脑组织和原代星形胶质细胞中转录因子Hif1α蛋白的表达水平。结果:(1)在成功复制出小鼠EAE模型和体外培养出原代星形胶质细胞的基础上,对芯片筛查下调的miRNA进行分析,结果显示,在抗原诱导的EAE模型小鼠(14d和20d)脑组织中,于对照组0.5倍以下的miRNA共有42个;而用IL-17体外刺激星形胶质细胞后3h和6h,低于对照组0.5倍以下的miRNA共有62个:体内外共同下调的miRNA为16个。(2)EAE小鼠病变的脑组织以及IL-17刺激小鼠原代星形胶质细胞(3h、6h)后,转录因子Hif1α蛋白的表达水平显著增加。结论:EAE模型小鼠病变的脑组织和IL-17刺激后的小鼠星形胶质细胞中出现了多个microRNA共表达下调,同时转录因子Hif1α呈现体内外共表达上调,且Hif1α与microRNA的表达时相基本一致。第二部分体外研究miR-497调控IL-17刺激星形胶质细胞产生某些炎症因子的作用与机制目的:体外探讨IL-17刺激小鼠原代星形胶质细胞诱生的miRNA调控Hif1α对IL-1β和IL-6生成的影响。方法:结合芯片筛查结果,用生物信息学软件预测可能与Hif1α 3’UTR区结合,并表达下调的miRNA;另通过Western blot和荧光素酶报告基因技术确证能调控Hif1α表达的miRNA,同时对已确定的miRNA再行Real-time PCR验证;此外,用Real-time PCR和ELISA法检查EAE小鼠脑组织(体内)和IL-17刺激星形胶质细胞(体外)后的IL-1β和IL-6的生成情况,并用荧光素酶报告基因和ChIP技术检查转录因子Hif1α对上述炎性因子基因表达的启动,以及Hif1α与IL-1β和IL-6基因启动子的结合情况。再者,用shIL-17RA沉默星形胶质细胞的IL-17RA,再行IL-17刺激,用Real-time PCR检测 miR-497 mRNA 的丰度,并用 Real-time PCR和 ELISA 检测 Hif1α 和 IL-1β、IL-6的表达水平;同时用miR-497的mimics和miR-497的抑制剂或Hif1α过表达质粒和Hif1α siRNA片段分别转染星形胶质细胞,再行Real-time PCR、Western blot和ELISA法检查其对Hif1α和IL-1β及IL-6产生的影响。结果:(1)体内外筛出的下调的miR-292-5p和miR-497能明显抑制IL-17诱导上调的Hif1α的表达,同时能降低重组Hif1α质粒(pGL3-Promoter/Hif1α)在HEK293T细胞中的荧光素酶活性,其中以miR-497的作用最为显著;(2)由IL-17刺激小鼠星形胶质细胞诱导上调的Hif1α能够明显增加IL-1β与IL-6的启动子活性,且Hif1α可与IL-1β、IL-6基因启动子直接结合;(3)沉默IL-17RA基因能够明显抑制由IL-17引起的miR-497的下调以及Hif1α与IL-1、IL-6表达的上调;另沉默miR-497的表达后,Hif1α、IL-1β、IL-6表达均显著上调,反之亦然;(4)星形胶质细胞中过表达Hif1α质粒,其分泌的IL-1β、IL-6明显增多,而用siRNA沉默Hif1α表达后,其前述炎性因子明显降低。结论:在IL-17刺激小鼠星形胶质细胞后,发生下调的miR-497可靶向核转录因子Hif1α并导致其转录上调,而上调的Hif1α又能直接启动IL-1β、IL-6的基因转录,进而促进IL-1β、IL-6基因的生成。