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以真可消化氨基酸(AA)营养体系评定家禽AA需要及饲料AA营养价值具有更高的准确性。准确测定家禽采食实际含氮日粮时内源氨基酸损失量(Endogenous amino acid losses,EAAL)是建立真可消化AA营养体系的核心和技术难点。本课题组初步建立了一次注射小剂量同位素标记亮氨酸(Leu)检测家禽采食实际含氮日粮时EAAL的方法(简称一次注射法)。一次注射法的核心假设是同一生理条件下,给采食不同日粮的家禽一次注射同一剂量的同位素标记Leu后,排泄物(食糜)内源AA中同位素丰度与血浆游离AA中同位素丰度之比相等,根据此假设并参考无氮日粮可测算出采食实际日粮时的EAAL。前期研究表明,在日粮蛋白质水平(CP)≤5%时,一次注射法是可行的,但仍需在日粮蛋白质水平较宽范围内验证其可靠性。本研究以15N-Leu为示踪物,采用同位素稀释技术,拟在日粮CP水平为0~21%的较宽范围内系统检验一次注射法的可行性和可靠性,并完善此方法。1.一次注射15N-Leu示踪法测定鸡内源氨基酸损失量适宜参数的研究试验一,研究气相色谱-质谱(GC-MS)分离测定15N-Leu的适宜参数,优化分析条件和适宜的丰度测定范围,为快速、准确测定样品15N丰度奠定基础。试验二,以48只罗曼褐公鸡为对象,采用2×3双因素试验设计,系统研究15N-Leu的引入方式(肌肉注射和静脉注射)和注射剂量(10、20和30 mg/kg·BW)对肠道内源AA主要分泌源中Leu的15N丰度(APEL)的影响,旨在优化15N-Leu的引入参数。结果表明:(1)Leu经MTBSTFA衍生后的衍生物在GC-MS上的最大特征碎片离子峰为m/z=200;当样品APEL<0.1%时,测定测定精准度(13.1%)和准确度(13.8%)较差;当样品的APEL为0.1%~3.2%时,测定精准度和准确度分别为4.3%~9.7%和-5.9%~4.1%,所得到的同位素稀释曲线线良好,R2值达到0.989;(2)当15N-Leu引入剂量为10 mg/kg·BW时,样品的APEL均小于0.1%,且静脉注射的部分试鸡在注射部位出现淤血、外渗现象;当引入剂量为10和20 mg/kg·BW时,各主要分泌源间的APEL均无显著差异(P>0.05);而当引入剂量为30 mg/kg·BW时,血浆的APEL显著低于肝脏和胰腺的APEL;(3)15N-Leu引入方式和剂量对内源AA主要分泌源的APEL不存在交互作用(P>0.05);APEL均随引入剂量的增大而显著增加(P<0.05),引入方式对肝脏的APEL无显著影响(P>0.05),而显著影响胰腺和肠粘膜的APEL(P<0.05)。以上结果表明,15N-Leu引入剂量为20 mg/kg·BW可达到GC-MS分析要求,同时选取肌肉注射可减少动物应激、简化操作程序,并有望降低成本。2.一次注射15N-Leu示踪法测定鸡内源氨基酸损失量的可靠性本试验以排泄物中粗粘液蛋白(CM)的15N-Leu作为内源总15N-Leu的指示物,结合蛋白梯度推算法,在CP水平为0~21%的较宽范围内进一步检验一次注射法的可靠性。选用48只体重一致的去盲肠罗曼褐公鸡,随机等分为8个处理组,以豆粕为唯一蛋白质来源,各组CP水平分别为0、3%、6%、9%、12%、15%、18%和21%,每组6重复。代谢试验采用48 h空腹+48 h全收粪法,每只试鸡精确强饲25 g/kg·BW试验日粮后,立即肌肉注射20 mg/kg·BW的15N-Leu,24 h后采集血液,连续收集48 h排泄物。分别测定血浆游离Leu、排泄物CM中Leu及排泄物总Leu的15N丰度(分别表示为15NLp、15NLcm和15NLd)。试验结果表明:(1)不同处理组间15NLcm与15NLp的比值介于0.664~0.763,差异不显著(P>0.05),表明在较宽日粮CP范围内一次注射法的基本假设成立;(2)除Ile、Ala、Asp、Cys、Pro和Ser外,其他AA内源损失量占总AA内源损失量的比例在不同CP水平时无显著差异(P>0.05),不同CP水平段时各个AA内源损失量的相对大小的顺序基本一致,Glu、Asp均为内源损失量较大的AA,其次为Thr、Ser、Pro和Val;(3)一次注射法计算的各CP水平段中高、低CP水平下的EAAL值与蛋白梯度推算法计算的该CP水平段的EAAL均值均无显著差异(P>0.05),两种方法测定的总AA内源损失量随CP水平的变化曲线基本吻合;采用一次注射法计算的各组总AA内源损失量分别为10.21、10.96、13.18、17.34、20.51、20.11、21.90和22.46 g/kg·DMI。以上结果表明,在更宽的日粮蛋白质水平范围内(0~21%),15NLcm/15NLp比值保持相对稳定,内源AA组成模式比较一致,采用一次注射法可检测家禽采食实际含氮日粮时EAAL具有较高的可靠性。本研究表明,一次注射法可检测家禽采食实际含氮日粮时EAAL。为减少应激、降低成本,建议使用一次注射法时注意以下要点:采用去盲肠家禽;肌肉注射15N-Leu,剂量为20 mg/kg·BW;15N-Leu引入后第24 h采集血液,连续收集48 h内排泄物。