鲫鱼作为我国淡水养殖业的重要经济鱼类之一,具有肉质鲜美等特点。然而,近年来,疱疹病毒性造血器官坏死病(herpesviral haematopoietic necrosis,HVHN)对鲫鱼的高致死率给我国鲫鱼养殖行业带来了巨大的经济损失。该病病原主要是鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)。Cy HV-2是一种线性双链DNA病毒,基因组大小为290kb,已知的开放阅读框共有151个,病毒的核衣壳对称于二十面体,直径约为120nm。它外层被囊膜蛋白包裹,呈椭圆形,直径175-200nm。病毒囊膜蛋白的主要功能是帮助病毒进入宿主细胞,在识别宿主、入侵细胞和病毒的抗原性等方面发挥重要作用。ORF25n是Cy HV-2的ORF25多基因家族之一,该基因编码病毒的膜蛋白,含有免疫球蛋白样结构域,根据本实验室之前的研究结果,表明ORF25n蛋白质有很好的保护和免疫原性,并可以作为理想的抗原。本研究针对Cy HV-2病毒具有良好免疫原性的囊膜蛋白ORF25的另一段截短蛋白设计特异性引物,目的片段经PCR扩增,连接至原核表达载体p ET-32a,转化成BL21大肠杆菌,由IPTG诱导过夜表达,用试剂盒透析纯化后进行ELISA的包被,研制出检测Cy HV-2的ELISA快速检测试剂盒,效果显著。此外,以Cy HV-2 DNA为模板构建了Cy HV-2 ORF25n真核表达质粒,PCR扩增出ORF25n基因,PCR产物经酶切回收并且纯化目的片段后,与经过相应的酶切后的真核表达载体pc DNA3连接,连接产物经PCR和酶切鉴定,再经测序鉴定正确后,选用不同浓度的质粒对鲫鱼进行肌肉注射免疫,免疫28日后选取不同组别鲫鱼进行Cy HV-2病毒的攻毒测试,计算免疫保护率,并对剩余鱼进行二次免疫,二免28日后进行免疫保护测试,此外对一免鲫鱼进行定期的各组织质粒留存检测。结果,成功扩增了ORF25n基因,长度为585 bp,并成功构建了ORF25n的真核表达质粒pc DNA-ORF25n。免疫攻毒结果表明,将构建的重组质粒pc DNA-ORF25n、空质粒pc DNA3分别免疫鲫鱼。免疫后用Cy HV-2强毒进行攻毒,检测不同浓度免疫组的免疫保护率,2.5g免疫组的保护率在一次免疫后可以达到50%,2.5g免疫组的保护率二次免疫后可达到75%。此外,免疫后12h至7日,注射部位肌肉组织和肝、脾、肾、脑都可以检测到pc DNA-ORF25n质粒存在。表明,注射免疫后,真核表达质粒pc DNA-ORF25n可短期在鱼体内进行复制,并通过体内抗原表达对鲫鱼进行免疫,使对免疫鲫鱼获得对Cy HV-2的抵抗力。对pcDNA-ORF25n质粒免疫后的鲫鱼各组织进行免疫因子表达情况的检测,检测的免疫因子包括补体3(C3)、I型干扰素(IFN-γ)、白细胞介素1β(IL-1β)和主要组织相容性复合体(MHC)以及免疫球蛋白M(Ig M)基因。q PCR检测结果表明,IFN-γ、C3、Ig M基因与对照组相比差异不显著(p>0.05);脾脏组织中,5μg浓度免疫组IL-1β基因的表达量呈现先增加后降低的趋势,与对照组相比差异显著(p<0.05),其在第5d时达到峰值,脾脏中MHC I的表达量也显著高于对照组(p<0.05),且在第5d时达到峰值。结果表明,经核酸疫苗免疫后,激活了鲫鱼的免疫细胞,增强了免疫细胞的相互识别能力,说明,pc DNAORF25n质粒免疫不但可以提高鲫鱼抗Cy HV-2的能力,还可增强鱼体自身的免疫应答能力,具有较高的应用价值。