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细胞自噬是真核生物细胞进化上高度保守的维持细胞自我平衡的途径,大量的实验数据表明自噬在生理和病理状态下都发挥着调节生物学活性的功能,并且被认为是一个关键的机制。自噬功能障碍与大部分的疾病都相关,其中自噬在癌症中的作用极为重要,这方面的研究也成为了国际热点,但很多机制仍有待进一步研究。肿瘤相关巨噬细胞是浸润在肿瘤微环境的一群主要的炎性免疫细胞,它是肿瘤微环境中的重要组成部分,它影响着肿瘤的发生、血管再生、免疫抑制、肿瘤转移和化疗耐受等[3]。巨噬细胞一般分为M1和M2两个亚型,M1型巨噬细胞通常被认为是起着正向免疫调节作用的细胞,它可以杀伤病原微生物和肿瘤细胞；M2型巨噬细胞可以抑制Thl适应性免疫应答,参与炎症的缓解作用,促进血管生成和组织修复,有利于肿瘤的发生发展[4]。大量研究表明肿瘤相关巨噬细胞在表型和功能上都更倾向于M2型巨噬细胞,并且在肿瘤微环境中起着重要的调节作用。肿瘤相关巨噬细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,但是它在荷瘤小鼠及肿瘤患者体内产生的机制仍有待进一步阐明。本课题组前期研究发现肿瘤细胞在体外培养条件下可以释放自噬小体至细胞外,我们还发现肿瘤细胞释放的自噬小体(Tumor cells released autophagosomes, TRAP)能在体内外诱导小鼠巨噬细胞成为M2样巨噬细胞,TRAP诱导的M2样巨噬细胞在体外可抑制T细胞增殖,并且这种抑制作用需要细胞间的直接接触。同时TRAP可以显著上调小鼠巨噬细胞负性调控分子PD-L1的表达,提示其可能发挥抑制功能。许多肿瘤病程中会产生含有大量肿瘤细胞和巨噬细胞的恶性胸腹水,由于肿瘤在形成发展阶段要经历低氧、低血供的营养匮乏过程,促使肿瘤细胞产生高水平的自噬现象。所以我们猜想肿瘤患者恶性胸腹水中可能存在自噬小体,并且会对其中的巨噬细胞产生一定的影响。鉴于恶性胸腹水标本容易获得,所以本课题将以恶性胸腹水为研究对象,结合本课题组前期研究结果探讨hTRAP对人单核／巨噬细胞的活化和免疫调节功能的影响。目的：1.检测并分析肿瘤患者恶性胸腹水来源巨噬细胞的细胞表型及免疫调节功能。2.探讨肿瘤患者恶性胸腹水来源自噬小体(hTRAP)对人单核／巨噬细胞活化及其免疫调节功能的影响。方法：1.肿瘤患者恶性胸腹水来源巨噬细胞细胞表型及免疫调节功能的检测与分析1.1收集临床肿瘤患者恶性胸腹水标本26例,分别采用流式细胞术检测胸腹水中巨噬细胞CD163和PD-L1表达水平、ELISA法检测胸腹水中IL-10和IFN-γ浓度,并采用SPSS 23.0软件对获得的数据进行统计学分析。1.2从胸腹水中用磁珠纯化获得巨噬细胞,加入抗CD3单抗刺激CFSE标记的hPBMC体外增殖的培养体系中,4天后流式细胞术检测CD4+T和CD8+T细胞的增殖情况。2. hTRAP诱导人单核/巨噬细胞极化及其免疫调节功能的研究2.1采用差速离心法获得恶性胸腹水中的自噬小体提取物。采用流式细胞术、Western blot和透射电子显微镜等方法对自噬小体提取物进行定性和定量鉴定与分析。2.2采集获得健康人外周血单核细胞并经M-CSF诱导7天成为巨噬细胞,将hTRAP与人巨噬细胞共孵育1天后,采用Q-PCR法检测巨噬细胞NOS2、 IL-10和PD-L1的mRNA水平。将hTRAP和健康人外周血单个核细胞共孵育3天后,采用流式细胞术检测巨噬细胞HLA-DR、CD86、CD163、CD206和PD-L1膜分子的表达水平。2.3收获与hTRAP共孵育3天的巨噬细胞,分别与抗CD3单抗刺激CFSE标记hPBMC继续混合共培养和Transwell培养,4天后采用流式细胞术检测CD4+T和CD8+T细胞的增殖情况。结果：1.肿瘤患者恶性胸腹水来源巨噬细胞细胞表型及免疫调节功能的检测与分析1.1与健康人外周血单核细胞相比,肿瘤患者恶性胸腹水中巨噬细胞CD163的表达比例显著升高。1.2恶性胸腹水中表达PD-L1巨噬细胞的比例显著高于健康人外周血单核细胞,恶性胸腹水中IL-10和IFN-γ浓度高低不同。1.3统计学分析显示：恶性胸腹水中巨噬细胞表达CD163和PD-L1之间呈正相关性关联。恶性胸腹水中IFN-γ浓度和恶性胸腹水中巨噬细胞表达PD-L1之间也呈正相关性关联。1.4胸腹水中来源巨噬细胞抑制T细胞增殖,T细胞增殖体系中加入胸腹水中巨噬细胞后CD4+T和CD8+T细胞的增殖比例明显降低。2.hTRAP诱导人单核／巨噬细胞极化及其免疫调节功能的研究2.1肿瘤患者恶性胸腹水中存在自噬小体。1)流式细胞术检测显示恶性胸腹水提取物表达LC3B,比例高达90%以上。2) Western blot检测恶性胸腹水提取物中含有LC3I和LC3ⅡI蛋白且LC3ⅡI蛋白量明显高于LC3I蛋白。3)透射电子显微镜观察发现提取物中含有大量直径在100-1000nm不等、具有双层膜结构的自噬小体。2.2统计学分析显示：肿瘤患者恶性胸腹水中自噬小体的浓度高低不同,与胸腹水中巨噬细胞表达PD-L1呈正相关性关联。2.3健康人巨噬细胞与hTRAP共孵育1天后,Q-PCR检测发现hTRAP刺激组NOS2 mRNA水平与未刺激组相比明显下降,而IL-10和PD-L1 mRNA水平显著升高。hPBMC和hTRAP共孵育3天后,流式细胞术检测发现hTRAP刺激组HLA-DR和CD86膜分子表达水平与未刺激组相比有所降低,CD163、 CD206和PD-L1膜分子表达水平与未刺激组相比均明显升高。2.4流式细胞术检测显示：与对照组相比,hTRAP刺激巨噬细胞与T细胞混合共培养明显抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖；而hTRAP刺激巨噬细胞与T细胞进行Transwell培养,CD4+T和CD8+T细胞的增殖未发生明显变化。结论：1.肿瘤患者恶性胸腹水中有大量PD-L1上调表达的M2样巨噬细胞。恶性胸腹水来源巨噬细胞能抑制CD4+T和CD8+T细胞的体外增殖。恶性胸腹水来源巨噬细胞上调表达PD-L1可能与胸腹水IFN-γ水平存在关联。2.肿瘤患者恶性胸腹水中存在自噬小体(hTRAP),并与恶性胸腹水来源巨噬细胞PD-L1表达呈一定正相关。3.肿瘤患者恶性胸腹水来源hTRAP能活化人单核/巨噬细胞成为M2样巨噬细胞并上调其PD-L1的表达,hTRAP诱导M2样巨噬细胞通过细胞间直接接触方式抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖。