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一、研究目的本文通过建立阿霉素诱导的心脏毒性大鼠模型和阿霉素刺激体外培养的H9C2心肌细胞,同时给予SalB进行干预,探讨SalB改善阿霉素心脏毒性的作用以及分子机制,为临床蒽环类药物化疗方案中心脏保护剂的运用提供实验依据。二、实验研究(一)模型的制备与判定本实验采用以剂量递增(1,1.5,2,2.5,3mg·kg-1)的方式,按照体重以lm·100g-1每隔2天腹腔注射阿霉素,复制大鼠心衰模型。4周后观察到大鼠萎靡不振、活动、进食减少、呼吸加快、体温下降、体重明显减轻,且左心室内压降低至正常值的2/3,符合Bishop关于慢性心衰动物模型的标准,表明阿霉素方法复制心脏毒性模型成功。(二)SalB对阿霉素诱导心脏毒性大鼠的保护作用以及机制研究1.SalB对阿霉素诱导的心衰大鼠血流动力学的影响。本实验采用MAP生理记录仪检测大鼠左心室收缩压LVSP,左心室舒张压LVDP,左心室最大上升速率(+)dp/dt,左心室最大下降速率(-)dp/dt,动脉收缩压ASP以及心率HR。结果显示：与模型组相比,随着给药持续时间的增加,SalB各组呈剂量依赖性地升高大鼠LVSP. (+)dp/dt、HR和ASP,降低大鼠(-)dp/dt、LVDP等参数(P<0.05)。表明SalB能够缓解阿霉素引起心功能的降低。2. SalB对阿霉素诱导的心衰大鼠组织形态方面的影响。制作病理心肌组织切片,进行HE、Masson和8-OHdG免疫组化染色,观察Sa1B对胶原纤维、间质形态以及炎症浸润的影响。病理结果显示SalB能明显减轻阿霉素诱导的心肌细胞的病变、减少炎症浸润,降低胶原纤维的含量和8-OHdG的表达,对心肌细胞形态结构具有保护作用(P<0.05)3. SalB对阿霉素诱导的心衰大鼠NO、TNOS、TSH、SOD、MDA的影响。采用试剂盒检测大鼠血清和心脏组织中丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)、一氧化氮(NO)总一氧化氮合成酶(TNOS)以及总巯基(TSH)含量变化。结果显示：与模型组相比,随着给药持续时间的增加,不同剂量的SalB能明显降低模型组大鼠心脏组织中MDA的含量,降低血清TNOS活性,抑制NO的生成,减少自由基对心脏的损伤。SalB还能增强TSH、SOD的活性,增加机体清除自由基的能力,对心肌细胞起到保护作用(P<0.01)4. SalB对阿霉素诱导的心衰大鼠炎症因子TNF-α、IL-6的影响。采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6的活性,观察不同剂量的SalB对大鼠血清中TNF-a, IL-6的活性影响。结果显示：SalB 25.4和12.5mg·kg-1剂量组能显著降低阿霉素诱导的TNF-a的生成(P<0.05,P<0.01),同时不同剂量的SalB均可抑制大鼠血清中IL-6的活性(P<0.01)。以上表明SalB能显著抑制炎症因子的生成,从而减少炎症诱发的心肌损伤,起到对心脏的保护作用。5. SalB对阿霉素诱导的心衰大鼠NF-kB的影响。采用Western Blot检测心脏组织NF-kB蛋白表达,观察不同剂量的SalB对NF-kB蛋白表达情况。实验结果显示：模型组阿霉素使大鼠心肌细胞中NF-kB大量表达(P<0.01)oSalB不同剂量组明显降低心脏组织中NF-kB表达,抑制了一系列促凋亡基因的活化和信号通路,降低细胞凋亡的发生率(P<0.01)。6. SalB对阿霉素诱导的心衰大鼠SIRTl及下游蛋白表达的影响。采用Western Blot方法检测SalB对阿霉素诱导的心脏毒性大鼠心脏组织中SIRT1、P-FOXO3a、MnSOD蛋白表达的影响。Western Blot结果显示：模型组阿霉素下调心肌细胞的SIRT1,P-FOXO3a,MnSOD的表达,Sa1B不同剂量组显著增加SIRT1,P-FOXO3a,MnSOD的蛋白表达(P<0.01)。提示,SalB降低阿霉素心脏毒性与SIRT1蛋白有关。(三) SalB对阿霉素诱导的H9C2心肌细胞的作用机理研究1.MTT筛选最佳阿霉素和SalB浓度。采用MTT细胞增殖与毒性试剂盒筛选最佳阿霉素和SalB的浓度。MTT实验结果显示：不同浓度的阿霉素对H9C2心肌细胞活性呈现抑制作用。2umol·L-1浓度的阿霉素刺激12h后,可显著抑制H9C2心肌细胞的活力(P<0.01)。而SalB各给药组对H9C2心肌细胞均有不同程度的增殖作用,呈一定的量效关系,60umol·L-1浓度的SalB刺激12h后细胞增殖作用最强(P<0.01)。2. SalB对阿霉素诱导的H9C2心肌细胞氧化损伤的保护作用。以H9C2心肌细胞为研究对象,应用阿霉素和烟酰胺进行干预,采用倒置显微镜观察SalB对阿霉素诱导心肌细胞形态的影响,通过流式细胞仪检测心肌细胞中线粒体膜电位大小；采用DCFH-DA荧光探针检测心肌细胞内ROS的含量变化。结果显示SalB能显著改善阿霉素诱导的心肌细胞形态学的异常变化,降低细胞的死亡率(P<0.01),减少心肌细胞内ROS含量的增加(P<0.01),升高阿霉素导致的线粒体膜电位的降低(P<0.01)。烟酰胺能抑制SalB对其的保护作用(P<0.01)。3. SalB对阿霉素诱导H9C2心肌细胞毒性中的氧化应激标志物SIRTl蛋白表达影响。采用Western Blot方法检测SalB对阿霉素诱导的H9C2心肌细胞毒性的氧化应激标志物SIRTl蛋白、FOXO3a磷酸化蛋白、MnSOD蛋白的表达水平。Western Blot结果显示：SalB能显著上调SIRT1蛋白水平的表达(P<0.01)、显著增加FOXO3a的蛋白磷酸化水平(P<0.01)、显著上调MnSOD蛋白表达量(P<0.01)。SIRT1特异性抑制剂烟酰胺能明显地阻断SalB对SIRTl蛋白的激活(P<0.01)。以上提示,SalB能上调氧化应激标志物SIRTl的蛋白。对阿霉素诱导的心肌氧化损伤具有保护作用。三、实验结论SalB改善了大鼠阿霉素诱导的心脏毒性,其机制可能是SalB降低氧化应激标志物SIRT1蛋白有关。