蛭弧菌的分离纯化及保质期的研究

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蛭弧菌是一类具有裂解多种革兰氏阴性细菌生理特性的寄生型细菌,这使其具有益生素和抗生素的双重特性。不同菌株蛭弧菌的裂解谱及裂解能力各不相同。同时蛭弧菌制剂也存在制备过程繁琐、保存期活性下降快、保存成本高的问题,在运输、保存的过程中,制剂中蛭弧菌的裂解活性受温度影响大。因此,优选一种对于环境及生物体内可能存在的致病菌,具有较好的裂解效果,并且可以与多种有益菌共存的蛭弧菌菌株,探究一种可以长期储存并保持蛭弧菌制剂活力的方法,对于将蛭弧菌制剂作为微生物制剂等产品应用于养殖水体及防控水产病害当中具有重大意义。采用以大肠杆菌为宿主菌的DNB双层平板对采集自海口的咸淡水海水样品进行筛选,得到一株咸淡水蛭弧菌,命名为蛭弧菌BDS02,使用15‰盐度的灭菌咸淡水琼脂双层平板纯化该株蛭弧菌,其噬菌斑直径在24~48h内由0.90mm扩大到3.50mm,透射电子显微镜下,其菌体呈杆状,菌体大小为1.28μm×0.57μm,后带一根鞭毛,鞭毛长度为3.17μm,最终判定其为蛭弧菌菌株。蛭弧菌BDS02对大肠杆菌GIM1.355、鼠伤寒沙门氏菌GIM1.237等10株致病菌具有良好的裂解效果,在24h即可形成多个噬菌斑,并对枯草芽孢杆菌等5株有益菌均无裂解效果。使用BDS02制备得到的蛭弧菌制剂中的蛭弧菌浓度为1010~1011pfu/mL,通过恒温经典加速实验的方法,优化出三种保护剂保质蛭弧菌制剂的最优浓度分别为5%(w/v)的谷氨酸钠、5%(w/v)的蔗糖和15%(v/v)的甘油,含有上述浓度保护剂的蛭弧菌制剂在4℃和10℃下相对活性Cr降至1%的保质期分别为63.3d和27.3d;63.6d和27.9d;62.7d和27.3d,与未添加保护剂的蛭弧菌制剂的保质期在相同温度下最多可延长33%;使用正交试验优选出的最佳保护剂组合为蛭弧菌制剂中各保护剂的浓度分别是:3%的谷氨酸钠、5%的蔗糖和13%的甘油,其在4℃及10℃下Cr达到1%、0.1%和0.01%时的保质期分别为95.5d、143.3d和191.0d及40.2d、60.3d和80.4d。三种保护剂均对蛭弧菌制剂的保质期有显著性影响,影响效果为蔗糖>甘油>谷氨酸钠。通过恒温储存实验验证正交试验及加速实验结果的准确性发现,保质期的误差值均在±0.59%内,符合要求。将使用BDS02制备的蛭弧菌制剂应用于养殖水体中,其结果显示,相同浓度不同状态的蛭弧菌制剂在控制细菌及弧菌的效果上没有显著差异(P>0.05),均在24h时快速减少总细菌的含量,最多可降低4个数量级,并且当水体中的蛭弧菌浓度维持在105pfu/mL时,可有效减缓其细菌的再生速度,添加蛭弧菌制剂的抑菌效果显著好于没有添加的组别(P<0.05);保护剂对于水体无污染效果,制剂中的蛭弧菌浓度以及水体中的总细菌浓度是影响其控制效果的重要因素。含有保护剂的蛭弧菌制剂在长时间储存后,其裂解活性未受到影响。
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