托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)作为天然药物已有数千年的使用历史,主要药用成分为莨菪碱(hyoscyamine),山莨菪碱(anisodamine)和东莨菪碱(scopolamine)。在现代医学中其作为抗胆碱类药物被广泛应用于麻醉、镇痛、治疗农药中毒以及缓解帕金森症等。TAs有着极高的药用价值和巨大的市场需求,但是目前完全依赖于从TAs含量极低的药源植物中提取,资源紧缺导致了其价格昂贵。颠茄(Atropa belladonna L.)是TAs最为重要的商业药源植物之一,因此培育高产TAs的颠茄植株一定程度上能够缓解TAs供需矛盾日益突出的现状。相关研究主要集中于通过代谢工程技术遗传改造生物合成途径来培育高产TAs的颠茄植株,但是,TAs作为次生代谢产物在植物体内的积累是存在限制的,所以为了培育更为高产TAs的颠茄还需要另辟蹊径。研究表明,提高资源植物生物量也是提高其目的成分产量的有效手段之一,也能用于培育高产TAs的颠茄植株,然而通过提高颠茄植株生物量的办法来提高TAs产量的研究还未见报道。生长素(auxin)是可以多方面调节植物的生长发育的一种植物激素,生长素响应基因也介导了其对植物生长发育和次生代谢的影响。Small Auxin Up-regulated RNA(SAUR)基因家族是生长素早期响应基因中最大的一个家族。最近,关于分子学、遗传学、生物化学和基因组学的研究表明SAUR参与了一系列细胞、生理和发育过程的调控。但是关于SAUR在颠茄等TAs药源植物中对于TAs生物合成的调控以及对植株生长发育的影响还尚未有研究报道。本研究基于颠茄转录组数据库,经过生物信息学分析选定了一条颠茄SAUR(命名为AbSAUR1)作为候选基因。对AbSAUR1进行了表达模式分析,然后建立了稳定遗传转化过表达AbSAUR1的颠茄植株用以进行田间试验,并进行了分子检测用以考察其对TAs生物合成的影响。进一步统计分析了其农艺性状以及TAs含量,对AbSAUR1在颠茄中的相关功能进行了研究,取得的研究结果如下:1.候选基因AbSAUR1的获得和表达模式分析本研究通过对颠茄转录组数据库进行分析,一共得到了40条颠茄SAUR基因(AbSAURs)。Pfam搜索分析结果表明,40条AbSAURs中均具有在SAUR家族中保守的生长素诱导型特征域(PF02519)。以目前研究最为系统和完整的拟南芥SAUR(AtSAURs)氨基酸序列为对照,与AbSAURs氨基酸序列一起构建系统进化树分析。发现有一条注释名为aba＿locus＿23134＿iso＿1＿len＿1028＿ver＿2的颠茄SAUR与AtSAUR41处于同一分支。相关研究表明AtSAUR41在分生组织中具有独特的表达模式,过表达会导致出现多效生长素相关的表型,包括长下胚轴、侧根旺盛和生物量增加,推测其可能有与AtSAUR41类似的功能。将40条AbSAURs和目前已报道的TAs生物合成途径基因共同进行基因表达相关性分析,发现aba＿locus＿23134＿iso＿1＿len＿1028＿ver＿2在根中特异性表达,与TAs生物合成基因基因表达模式十分类似。根据系统进化树分析和表达相关性分析,选定aba＿locus＿23134＿iso＿1＿len＿1028＿ver＿2为候选基因,将其命名为AbSAUR1并开展后续研究。AbSAUR1的cDNA全长为1028 bp,编码区为510 bp,编码170个氨基酸残基的多肽,蛋白质相对分子量为19.1 kDa,等电点pI为9.65。采用qPCR分析了AbSAUR1在颠茄植株的主根、须根、茎、叶、花和果实中组织表达模式,AbSAUR1在颠茄根中特异性表达,在茎、叶、花和果实中不表达。AbSAUR1在须根中的表达量高于主根,其组织表达模式与已知TAs生物合成基因在须根中特异/高表达的模式高度类似。使用生长素(0.35μm IAA)对野生型颠茄植株进行时间梯度处理,生长素处理2 h后,AbSAUR1的转录本积累量就得到了显著性提高,6 h时表达量的提高达到最大,证实了AbSAUR1受到生长素诱导。2.过表达AbSAUR1颠茄植株的建立及分子检测本研究构建了p1305~+-AbSAUR1过表达载体并通过农杆菌侵染外植体最终获得了稳定遗传转化的转基因颠茄植株。通过PCR实验对筛选标记基因NPTII和35S::AbSAUR1融合片段进行检测,证实过表达载体p1305~+-AbSAUR1和p1305~+空质粒分别成功整合到颠茄的基因组中,成功获得过表达AbSAUR1和p1305~+空质粒对照转基因颠茄植株。采用qPCR分析检测了AbSAUR1以及TAs生物合成相关基因的表达量,p1305~+-AbSAUR1过表达株系中AbSAUR1的表达量相较于对照提高了23.75倍左右,而TAs生物合成相关基因,包括了AbODC、AbPMT、AbTRI、AbCYP80F1和AbH6H,都没有出现显著性变化。表明了过表达生长素下游响应基因AbSAUR1不会抑制TAs生物合成途径基因的表达。3.过表达AbSAUR1颠茄植株的农艺性状分析在田间实验中,过表达AbSAUR1颠茄植株出现了一系列的表型变化,包括了株高增加,茎部变粗,叶片数、分支数和根系增多等等。对其部分农艺性状进行分析,过表达AbSAUR1株系株高是对照株系的1.23倍,茎粗达到了对照株系的2.14倍。过表达AbSAUR1株系茎部分支增加,平均为5个。过表达AbSAUR1株系的生物量也得到了显著性提高,对照株系单株的鲜重和干重分别为125.46±22.43 g和35.59±6.75 g,过表达AbSAUR1株系的平均鲜重和干重为495.05±36.88 g和113.84±7.36 g,达到了对照株系的3.79倍和3.20倍。对照株系叶片的鲜重和干重为34.42±5.39 g和7.90±2.51 g,过表达AbSAUR1株系的平均鲜重和干重为133.90±13.36 g和24.66±2.92 g。对照株系根部的鲜重和干重为39.36±8.38 g和11.22±2.84 g,过表达AbSAUR1株系的平均鲜重和干重为90.21±12.58 g和22.80±1.41 g。农艺性状分析结果表明,过表达AbSAUR1能够正向调控颠茄的生长发育,并能显著性促进生物量积累。4.过表达AbSAUR1颠茄植株TAs产量分析在过表达AbSAUR1株系和对照株系中,莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的含量,无论是根系或者叶片中都没有出现显著性差异,证实了TAs的生物合成能力并没有因为AbSAUR1的过表达受到抑制。同时过表达AbSAUR1株系生物量的显著性提高,TAs的产量从而得到了显著性提高。在过表达AbSAUR1植株的根系中,莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的产量分别是37.37±11.16 mg、40.69±12.62 mg和5.42±2.21 mg,对照株系根中TAs的产量为莨菪碱10.55±3.06 mg,山莨菪碱16.24±3.07 mg和东莨菪碱1.56±0.43 mg。p1305~+-AbSAUR1过表达株系叶片中的莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱产量的平均值分别为38.48±16.02 mg,8.69±3.54 mg和14.37±2.19 mg,分别是对照株系产量的6.25倍、6.30倍和2.92倍。综合整株而言,p1305~+-AbSAUR1过表达株系单株的莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱产量分别是对照株系的4.54倍、2.80倍和3.06倍。TAs分析的结果表明了过表达AbSAUR1对TAs含量基本没有影响,但是其能够通过提高生物量从而显著性提高TAs产量。本研究在颠茄中克隆得到了AbSAUR1,然后在颠茄中超量表达AbSAUR1基因并进行了田间实验,分析评价了AbSAUR1对植株生长发育的影响。结果表明,过表达AbSAUR1能够促进植株的生长发育,导致生物量得到显著性提高,而且不会抑制TAs生物合成,最终能够显著性提高单株颠茄TAs产量。本研究首次在颠茄中报道并鉴定了SAUR基因,并且较为系统的研究了AbSAUR1对颠茄生长发育以及TAs生物合成的影响,为培育高产TAs颠茄植株提供了新的思路与方法,填补了关于颠茄植株生物量研究领域的空白,具有一定的理论和应用价值。